咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)揮發(fā)性成分的頂空-氣相色譜-質(zhì)譜分析

金實(shí)，肖鋒，胡曉雪，段雪云，熊義濤，王金波，李成銀，孫婉瑾

(1.湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北武漢 430074)

中醫(yī)內(nèi)病外治法應(yīng)用歷史悠久，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》和《傷寒雜病論》中就有相關(guān)記載[1]。清代吳師機(jī)《理瀹駢文》闡述了經(jīng)絡(luò)的作用，認(rèn)為外治法是通過體表經(jīng)絡(luò)到達(dá)體內(nèi)而發(fā)揮治療作用。依據(jù)十二經(jīng)脈循行走向，手太陰肺經(jīng)循行由肺至手，因此可通過浸手法從肺論治咳喘[2]；足太陰脾經(jīng)循行由足至脾，而脾為生痰之源，故咳喘合并痰多的可通過泡足法由脾論治[3]。小兒臟腑嬌弱、肺衛(wèi)不固，外感寒邪易侵入肺衛(wèi)，肺失宣降而發(fā)咳嗽；另外，小兒脾常不足、脾虛不運(yùn)，阻遏肺氣，肺氣上逆而積濕生痰?；谝陨仙聿±硖攸c(diǎn)，小兒哮喘、肺炎、支氣管炎等常有咳喘含痰之癥[4]。但是小兒應(yīng)用口服藥和注射劑等治療順應(yīng)性差，副作用大[5-6]，因此，應(yīng)用中藥進(jìn)行浸手浴足是治療小兒咳喘的佳選，且小兒皮膚薄嫩，透皮吸收效果更佳。

咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)是我院兒科劉曉鷹教授經(jīng)驗(yàn)方，在臨床應(yīng)用數(shù)年，深受患者好評(píng)。其處方由麻黃、細(xì)辛、桂枝、吳茱萸及鵝不食草組成，藥材粗粉加適量沸水進(jìn)行熏蒸，水溫合適后浸手浴足。麻黃、細(xì)辛、桂枝、吳茱萸、鵝不食草等均含有豐富的揮發(fā)性成分[7-11]，有報(bào)道證明麻黃、細(xì)辛、吳茱萸和鵝不食草揮發(fā)油均具有平喘功效[12-15]。并且越來越多的研究表明中藥揮發(fā)性成分中的單萜和倍半萜類天然化合物具有促進(jìn)透皮吸收的作用，其特點(diǎn)為起效快、促滲作用強(qiáng)、不良反應(yīng)少等[16-19]，主要促滲機(jī)制為擾亂皮膚角質(zhì)層的高度有序排列、“拉動(dòng)效應(yīng)”及增強(qiáng)皮膚角質(zhì)層的水合作用等[20]。

本研究采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜(HS-GC-MS)聯(lián)用方法進(jìn)行咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)揮發(fā)性成分分析，確立共有特征峰，并進(jìn)行指認(rèn)。對(duì)其中可能存在的活性成分和促進(jìn)透皮吸收的成分進(jìn)行定性分析，為該制劑的后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)，包含7697A型頂空進(jìn)樣器、G4513A型自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)、Agilent Masshunter Qualitative Analysis定性工作站、NIST17型質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；真空機(jī)械泵(德國Pfeiffer Vacuum公司)；ES2252SM-DR十萬分之一天平(瑞士Precisa公司)；高純氦氣(純度≥99.999%，武漢華星工業(yè)技術(shù)有限公司)。

1.2 試藥

麻黃、細(xì)辛、桂枝、吳茱萸及鵝不食草，經(jīng)湖北省中醫(yī)院主任藥師段雪云鑒定，符合《中國藥典》2015版一部要求。處方量五味藥材混合后40目粗粉制備咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)，本實(shí)驗(yàn)所用10批供試品[S1～S10，批號(hào)分別為20190501(分裝)、20190501、20190102、20181201、20181001、20180701、20180518、20180501、20180323、20180110]均由湖北省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)性成分的提取

咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)在臨床使用的方法是藥材混合粗粉加適量沸水(100 ℃)持續(xù)加熱進(jìn)行熏蒸，停止加熱待水溫合適后浸手浴足。參考應(yīng)用HS-GC-MS技術(shù)對(duì)麻黃、細(xì)辛和吳茱萸進(jìn)行成分分析的文獻(xiàn)[8，10，21]，并在一定的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)頂空提取揮發(fā)性成分的方法條件。

精密稱取各批次咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)供試品0.5 g，置于10 mL頂空進(jìn)樣瓶中，封口密閉，依次置頂空進(jìn)樣器中按以下條件進(jìn)樣：樣品瓶加熱溫度100 ℃，定量環(huán)溫度105 ℃，傳輸線溫度110 ℃，加熱40 min，提取咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)易揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。

2.2 氣相色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)，載氣流量 1.0 mL/min；分流比100︰1，進(jìn)樣口溫度200 ℃，進(jìn)樣量1 μL；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持3 min，以 4 ℃/min 升至120 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至 160 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，轟擊電壓70 eV，正離子模式，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，數(shù)據(jù)采集模式為全掃描[22]。

2.3 化學(xué)成分分析

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件測(cè)定各批咳喘足浴方揮發(fā)性成分，提取電元文件，進(jìn)行比對(duì)，建立咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)揮發(fā)性成分共有圖譜(見圖1)，得到17個(gè)共有峰，譜庫檢索結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行識(shí)別，共識(shí)別出17種成分，保留時(shí)間、化學(xué)名稱、分子式和相對(duì)總成分的百分含量等相應(yīng)信息見表1。識(shí)別出3號(hào)峰為1R-(+)- α-蒎烯，5號(hào)峰為β-蒎烯，6號(hào)峰為月桂烯，7號(hào)峰為3-蒈烯，8號(hào)峰為D-檸檬烯，12號(hào)峰為2,3,5,6-四甲基吡嗪，以上幾種成分為處方藥材揮發(fā)油中主要成分，來源明確，歸屬可靠，并且在氣相色譜圖中分離較好。

圖1 咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)揮發(fā)性成分總離子共有圖譜

表1 咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)揮發(fā)性成分分析

3 討論

咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)是我院兒科劉曉鷹教授經(jīng)驗(yàn)方，辨證與辨病相結(jié)合，針對(duì)小兒咳喘的主要發(fā)病機(jī)制，反復(fù)甄選藥味組方而成，全方辛溫宣肺、降逆化痰，適用于風(fēng)寒犯肺、風(fēng)寒閉肺及寒性哮喘。麻黃、細(xì)辛、桂枝和鵝不食草均屬于辛溫解表、發(fā)散風(fēng)寒之藥，其中麻黃宣肺平喘，細(xì)辛溫肺化飲，桂枝平?jīng)_降氣，鵝不食草則通鼻竅、止咳；吳茱萸屬辛熱溫里藥，可散寒止痛，降逆止嘔[23]。方中5味藥材皆味辛，與所含豐富的揮發(fā)性成分密切相關(guān)[24]。麻黃、細(xì)辛、桂枝、吳茱萸、鵝不食草等均含有豐富的揮發(fā)性成分[7-11]，具有平喘相關(guān)功效[12-15]。

本研究采用HS-GC-MS技術(shù)對(duì)咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，結(jié)合臨床實(shí)際使用該制劑的方法，參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8，10，21]確立樣品瓶加熱溫度為100 ℃；根據(jù)HS-GC-MS設(shè)備的技術(shù)要求，傳輸線溫度要適當(dāng)高于定量環(huán)溫度，定量環(huán)溫度要適當(dāng)高于樣品加熱瓶溫度，確立定量環(huán)溫度105 ℃，傳輸線溫度110 ℃。如果條件溫度過低不符合實(shí)際應(yīng)用情況，溫度過高會(huì)影響結(jié)果重現(xiàn)性。通過頂空進(jìn)樣提取揮發(fā)性成分后進(jìn)行GC-MS分析，建立該制劑的揮發(fā)性成分HS-GC-MS圖譜，找到17個(gè)共有成分，進(jìn)行識(shí)別，充分反映出揮發(fā)性成分的組成情況。

本研究識(shí)別出的17個(gè)共有化合物均有相關(guān)文獻(xiàn)支持來自麻黃、細(xì)辛、桂枝、吳茱萸及鵝不食草，結(jié)合譜庫檢索進(jìn)行匹配，可以識(shí)別為表2列出的相應(yīng)化合物。早在1983年，孫靜蕓[25]就從麻黃平喘有效部位分離出了兩個(gè)具有平喘作用的單體，本研究中的No.12化合物2,3,5,6-四甲基吡嗪即是其中之一。2,3,5,6-四甲基吡嗪(川芎嗪)應(yīng)用于小兒哮喘的臨床研究報(bào)道也越來越多[26-28]，可能作用機(jī)制為：擴(kuò)張哮喘患者支氣管[29-30]；明顯抑制慢性和非特異性炎癥[31]；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮依賴性血管舒張因子而發(fā)揮擴(kuò)血管作用，從而改善哮喘患者的肺動(dòng)脈高壓[32]；減少哮喘患者的血小板激活因子和血栓素A2水平[33]。

咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)中麻黃、桂枝和細(xì)辛均含有D-檸檬烯，故而復(fù)方含量高達(dá)16.26%。D-檸檬烯是一種中草藥揮發(fā)油類的透皮吸收劑，不但可以促進(jìn)川芎嗪的透皮吸收[34]，而且本身也是一種具有鎮(zhèn)咳、祛痰和抗菌作用的有效成分；細(xì)辛和吳茱萸中含有的α-蒎烯同樣具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗真菌和促進(jìn)透皮吸收作用。檸檬烯、α-蒎烯和桉油精能協(xié)同起效，用于抗炎、擴(kuò)張支氣管和促使痰液排出，是桉檸蒎腸溶軟膠囊的有效成分，口服吸收良好，但其自身的透皮吸收程度還有待驗(yàn)證[35-38]。另外，本研究檢測(cè)出的月桂烯(No.6)、蒎烯(No.3和No.5)、蒈烯(No.7)等萜類化合物均為天然的經(jīng)皮給藥制劑的促滲劑[20]。

咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)中含有的揮發(fā)性成份無論是藥理作用還是促進(jìn)透皮吸收作用均與處方用于小兒咳喘治療相吻合。本研究僅針對(duì)本實(shí)驗(yàn)條件下的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，不排除處方中非揮發(fā)性成分通過透皮吸收進(jìn)入體內(nèi)起效，有待進(jìn)一步研究。川芎嗪為該方可能主要有效成分，但作為注射或者是口服劑型在小兒用藥上都有順應(yīng)性差和副作用大的劣勢(shì)，而咳喘浸手浴足Ⅰ號(hào)作為外用制劑不僅克服了這些缺點(diǎn)，還有透皮吸收給藥方式避免首過效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，為小兒咳喘治療提供了新的治療方式。