肝癌干細胞源性外泌體對肝癌細胞增殖耐藥性的影響

白金權(quán)，李柏文，魯 晶，李景東，范曉東，嚴智勇，朱 波，鄒向明，楊海松，杜希臣，韓 茜，梅博升 (吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院普通外科，吉林 吉林 132013)

肝癌早期無明顯癥狀，確診時大多數(shù)病人已失去手術(shù)治療時機，病死率居高不下[1]。傳統(tǒng)放化療治療肝癌尚未能取得良好的遠期療效，且存在較大的副作用。因此，如何提高肝癌的臨床療效仍是重大而緊迫的課題。外泌體是一種高效的細胞間信息交換通訊載體。研究表明[2]，外泌體除在局部作用促進腫瘤形成和增殖外，還可以通過影響細胞遷移和侵襲能力影響遠處細胞,在腫瘤早期診斷、監(jiān)測發(fā)展、提高治療效果等方面顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。肝癌干細胞的多藥耐藥性是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的關(guān)鍵[3]。本研究采集肝癌干細胞外泌體并將其作用于普通肝癌細胞，觀察其對肝癌細胞增殖和耐藥性的影響。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞MHCC97購自上海通蔚生物科技有限公司；DMEM F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；熒光染料Hoechst33342購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自南京森貝伽生物科技有限公司；TIAN script RT Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR GreenⅠ)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Western Blot檢測試劑盒購自美國博士德生物工程有限公司；FACSCalibur流式細胞儀購自BD公司；NanodropRND-1000購自NanoDrop公司；GelDoc-It TS Imaging System型購自上海金鵬分析儀器有限公司；WFH100B凝膠成像系統(tǒng)購自上海精科實業(yè)有限公司；MC-15K微型高速離心機購自上海精勝科學(xué)儀器有限公司；FV1000激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司；JEM-1010透射電子顯微鏡購自日本JEOL公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

MHCC97細胞復(fù)蘇后接種于DMEM/F12培養(yǎng)基中(含100 u/mL青霉素、100 u/mL鏈霉素和10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2、75%濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%融合度時倒掉培養(yǎng)基，胰蛋白酶-EDTA消化液(濃度0.25%)消化培養(yǎng)細胞成散在單個細胞，然后進行傳代。

1.3 肝癌干細胞分選

0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)的MHCC97細胞并制成單細胞懸液(細胞密度約為1×106～3×106/mL)。將其分為兩組，一組加入Hoechst33342至終濃度為6 mg/L，一組單細胞懸液中加入鈣通道阻滯劑維拉帕米進行對比，調(diào)節(jié)至終濃度為50 mmol/L。采用FACSCalibur全自動多色分析流式細胞儀對細胞進行檢測分選，選擇355 nm UV激光發(fā)射源進行檢測，測量前向散射和側(cè)向散射二維參數(shù)圖。根據(jù)流式細胞儀顯示的細胞二維散點圖形態(tài)及參數(shù)，選擇左下角熒光強度弱或者無表達的一小部分細胞，即為MHCC97細胞中的肝癌干細胞。

1.4 外泌體提取和實驗分組

將肝癌干細胞和MHCC97細胞均常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞培養(yǎng)基上清液。4 ℃的條件下離心:300×g離心10 min，2000×g離心20 min。然后將上清液移入無菌高速離心管中，分別在800×g離心30 min、1萬×g離心30 min、1萬×g離心60 min，收集顆粒，在PBS中重新懸浮，9萬×g離心60 min以去除細胞碎片。然后在30%蔗糖/D2O密度梯度以106×g下超離心180 min，收集蔗糖中沉淀，用PBS重懸，106×g下超離心60 min，收集沉淀即為外泌體。最后，將沉淀重懸于PBS中，并在-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肂radford assay(BioRad)測定蛋白濃度。取10 μL溶解外泌體的PBS懸液滴至電鏡銅網(wǎng)上放置20 min。戊二醛固定液(4%,電鏡專用)固定待觀察樣本30 min，PBS溶液洗滌3次，室溫下自然晾干。然后置于在JEM-1010透射電子顯微鏡下進行觀察并拍照。將提取的肝癌干細胞源性外泌體作用于MHCC97細胞(實驗組)，并設(shè)置對照組(常規(guī)培養(yǎng)的肝癌細分泌外泌體作用于MHCC97細胞)和普通組(常規(guī)培養(yǎng)MHCC97細胞)進行對比。

1.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗

①細胞增殖檢測：將各實驗組肝癌細胞以每孔平均5×104個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育4 h。移液器吸去孔板內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔中各加入150 μL DMSO溶液，振蕩器上振蕩10 min以充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物。在BioTek ELx800全自動酶標儀上，設(shè)置以490 nm波長檢測96孔板各孔的吸光度(OD)，以時間(d)為橫坐標，OD值為縱坐標來繪制細胞生長曲線圖，評估實驗?zāi)[瘤細胞的生長增殖情況。

②藥物敏感性實驗：按5×104/孔將各實驗組肝癌細胞接種到96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)72 h。配制不同濃度梯度的含5-氟尿嘧啶(5-Fu)和阿霉素(ADM)的培養(yǎng)基進行干預(yù)培養(yǎng)，每種藥物不同濃度分別設(shè)置5個復(fù)孔；同時設(shè)置無藥物干預(yù)的細胞對照組和無細胞的空白對照組。干預(yù)培養(yǎng)細胞24 h后，加入20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h，移液器吸去孔板內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入150 μL DMSO，振蕩器上振蕩10 min以充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物。在BioTek ELx800全自動酶標儀上，以490 nm波長檢測各孔的OD值，計算半數(shù)抑制劑量(IC50)。

1.6 實時熒光定量PCR

采用Trizol法提取各實驗組分離純化的外泌體中總RNA。cDNA的合成按照TIAN script RT Kit的說明進行操作。Total RNA 40 μg,10×DNaseⅠbuffer 5 μL,RNase Inhibitor 20 U，DNaseⅠ(RNase-free)2 μL(10 U)，加入RNase free dH2O至總體積50 μL，混勻，離心。反應(yīng)條件：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)：RT product 1 μL，10 μmol/L的PCR特異引物F 1 μL，10 μmol/L的PCR特異引物R 1 μL，2×Master Mix 10 μL，Nucleasr-Free Water 7 μL，加入RNase free dH2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 S、55 ℃ 30 S、72 ℃ 4 min、30個循環(huán)，72 ℃ 5 min。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT法分析檢測基因相對表達值。

1.7 Western Blot檢測

收集實驗組細胞分離純化的外泌體，按照每毫升樣品外泌體中加入0.1 mL的RIPA裂解液，放置于冰上裂解30 min，然后振蕩器上振蕩30 s。4 ℃條件下，12 000 g離心30 min。取上清，Bicinchoninic acid法對上清中蛋白濃度進行定量檢測。將樣品加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min。冷卻至室溫后用移液器加入到10%SDS-PAGE膠的上樣孔內(nèi)，40 V電壓下電泳3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，封閉液室溫下封閉1 h。加入一抗，室溫下孵育2 h后，TBST洗滌液洗滌3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育2 h，TBST洗滌液洗滌3次，每次10 min。ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相，Image Studio圖像分析軟件分析圖片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0中文版統(tǒng)計軟件對采集的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用均數(shù)±標準差對數(shù)據(jù)進行描述，采用t檢驗對組間數(shù)據(jù)差異進行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌干細胞分選

流式分選熒光散點圖顯示：A組左下角區(qū)域細胞占所有分選肝癌細胞的4.1%；在加入維拉帕米的B組中，該區(qū)域的細胞則明顯減少，相應(yīng)的細胞所占百分比也明顯降至0.4%；該區(qū)域細胞即為肝癌干細胞(圖1)。

圖 1 肝癌干細胞流式分選圖

2.2 分離提取的外泌體鑒定

透射電鏡下觀察(圖2)：從肝癌干細胞培養(yǎng)上清液樣本提取的物質(zhì)中可見散在分布的小囊泡，呈杯口狀或囊泡狀，50～120 nm直徑大小。Western blot檢測結(jié)果顯示，這些提取的物質(zhì)表達肝癌干細胞來源外泌體表面標志性蛋白CD63。

圖 2 肝癌干細胞來源外泌體電鏡下形態(tài)

2.3 外泌體對肝癌細胞增殖能力的影響

細胞MTT生長曲線結(jié)果顯示：外泌體對肝癌細胞的增殖有促進作用，因而實驗肝癌細胞各時間點OD值要明顯高于對照組和普通組，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而對照組和普通組各時間點OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

2.4 外泌體對肝癌細胞化療敏感性的影響

實驗組肝癌細胞對5-Fu和ADM的IC50明顯高于對照組和普通組，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組和普通組對5-Fu和ADM的IC50比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

2.5 外泌體中增殖和耐藥基因mRNA的表達

RT-PCR結(jié)果顯示(圖4)：實驗組肝癌干細胞外泌體中survivin、c-myc、ras癌基因和ABCG2、MDR-1、MRP-1耐藥基因的表達均明顯高于對照組的普通肝癌細胞，而抑癌基因P53和PTEN表達則明顯低于對照組(P<0.05)。

圖 3 各組肝癌細胞增殖曲線比較

表 1 各組肝癌細胞對5-Fu和ADM的IC50(mg/L)

圖 4 各組外泌體中基因表達比較

2.6 外泌體中增殖和耐藥基因蛋白的表達

Western blot灰度值檢測后顯示(表2)：實驗組肝癌干細胞外泌體中survivin、c-myc、ras、ABCG2、MDR-1、MRP-1基因蛋白的表達均高于對照組的普通肝癌細胞，而P53和PTEN基因蛋白表達水平值則低于對照組(P<0.05)。

3 討 論

腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)理論認為惡性腫瘤是由一個獨特的自我更新的癌細胞亞群按等級組織和維持的。腫瘤起始細胞位于金字塔的頂端，它們可以自我更新，通過細胞分裂形成相同的子細胞，并分化成各種類型的后代。CSCs具有對放療和化療的內(nèi)源性耐藥機制，具有生存優(yōu)勢。此外，CSCs可導(dǎo)致腫瘤組織中細胞組成的多樣性，產(chǎn)生表型不同的亞克隆，從而增加抗癌治療后的耐藥概率。越來越多的證據(jù)表明CSCs是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的關(guān)鍵所在[4]。近年來外泌體的發(fā)現(xiàn)為腫瘤細胞間耐藥性傳遞影響的機制提供了新的思路。外泌體是細胞間進行物質(zhì)和信息交流的重要媒介[5]。目前針對外泌體在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥性等研究領(lǐng)域已經(jīng)開展了大量的研究[6]。對肺癌的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移性肺癌細胞外泌體較低轉(zhuǎn)移肺癌細胞更能促進腫瘤細胞遷移。在體外誘導(dǎo)因素下，肺癌細胞能增加外泌體中TGF-β和IL-10的含量來提高對靶腫瘤細胞的遷移能力，進而促進其侵襲轉(zhuǎn)移。本研究采用FACS從人肝癌細胞MHCC97中分選出的SP細胞。結(jié)果顯示分選出的肝癌干細胞約占所有細胞的4.1%，這一結(jié)果與相關(guān)報道數(shù)據(jù)是一致的。

表 2 各組外泌體中基因蛋白表達水平

腫瘤干細胞能夠影響普通腫瘤細胞增殖、遷徙/轉(zhuǎn)移和耐藥性。研究表明腫瘤干細胞外泌體可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的關(guān)鍵所在[7]。Bourkoula等[8]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞外泌體能夠增強膠質(zhì)瘤細胞的生物學(xué)侵襲性。Setti等[9]也證實，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞源性的外泌體能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞體外增殖和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。而這可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞源性的外泌體中含有的氯離子通道1蛋白并傳遞給靶細胞有關(guān)。本研究將肝癌干細胞來源的外泌體同肝癌細胞進行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，肝癌干細胞來源的外泌體均能夠促進肝癌細胞的增殖，增強肝癌細胞對5-Fu和ADM的耐藥性。由于外泌體參與細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)傳遞,因此進一步檢測增殖和耐藥基因mRNA和蛋白的表達。結(jié)果顯示，肝癌干細胞外泌體中survivin、c-myc、ras癌基因和ABCG2、MDR-1、MRP-1耐藥基因的表達均明顯高于普通肝癌細胞，而抑癌基因P53和PTEN表達則明顯低于普通肝癌細胞。推測是肝癌干細胞來源的外泌體包含了促進增殖和化療耐藥相關(guān)功能活性介質(zhì)，在同普通肝癌細胞共同培養(yǎng)過程中通過傳遞并直接介導(dǎo)腫瘤細胞或者塑造腫瘤微環(huán)境來支持腫瘤的增殖和耐藥。

總之，本實驗證實了肝癌干細胞分泌外泌體作用肝癌細胞后能促進其增殖和化療耐藥，這種效應(yīng)可能與外泌體能通過胞間傳遞促增殖基因和耐藥蛋白有關(guān)。然而肝癌干細胞源性外泌體對細胞增殖和耐藥影響的相關(guān)機制尚不明確，還有待進一步深入研究。