山萸肉表面泛霜和發(fā)霉的鑒別

宋 霞,劉亞蓉,張國(guó)英,張春平,常 煒,凌 云

(青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院,青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉,具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫的功效。秋末冬初果皮變紅時(shí)采收果實(shí),用文火烘或置沸水中略燙后,及時(shí)除去果核,干燥[1]。山茱萸飲片分為山萸肉和酒萸肉2 種,其中山萸肉的炮制方法為除去雜質(zhì)和殘留果核,性狀與山茱萸藥材相同。隨著山茱萸被臨床廣泛使用,種植面積不斷擴(kuò)大,主要產(chǎn)地有河南欒川、嵩縣、西峽,陜西佛坪、周至,浙江臨安、淳安,以及山西沁縣等地。種植地域不同、氣候條件不同,所產(chǎn)山茱萸藥材品質(zhì)有很大差異；加之許多栽培品種的出現(xiàn),造成了市場(chǎng)上山茱萸藥材品質(zhì)不一。

本研究建立了山萸肉的性狀等級(jí)劃分方法,經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山萸肉的表面顏色隨著飲片儲(chǔ)存年限的增長(zhǎng),逐漸加深,由紫紅色變?yōu)楹谏?且表面逐漸失去光澤,即山萸肉表面顏色愈深飲片年限愈長(zhǎng),品質(zhì)越差；性狀研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)156 批山萸肉飲片中23 批表面具有一層厚厚的白色物質(zhì)(在性狀鑒別時(shí),難以直觀判斷出白色物質(zhì)是白霜還是發(fā)霉產(chǎn)生的白毛,外觀基本一致),且樣品表面顏色均為紫黑色至黑色(應(yīng)為陳貨),其中20 批鑒定為白霜,3 批鑒定為發(fā)霉長(zhǎng)出的白毛。經(jīng)查閱文獻(xiàn),山萸肉、紅棗貯藏過(guò)久,極易發(fā)霉變質(zhì),尤其是紅棗含有大量糖分,干燥不徹底,更易發(fā)霉[2]。發(fā)霉是中藥保管過(guò)程中吸潮所致,而與發(fā)霉現(xiàn)象表面較類似的泛霜現(xiàn)象原因有所不同,故應(yīng)對(duì)2 種現(xiàn)象加以識(shí)別[3-7]。有關(guān)中藥材泛霜和發(fā)霉的研究文獻(xiàn)較少[8-9],中藥材泛霜的化學(xué)成分和發(fā)霉霉菌種類鑒定均未見(jiàn)報(bào)道。查詢到較多文獻(xiàn)為山茱萸化學(xué)成分研究[10-13]。本研究建立了山萸肉表面泛霜和發(fā)霉的鑒別方法,白霜經(jīng)測(cè)定成分主要為果糖、葡萄糖和蔗糖,發(fā)霉產(chǎn)生的白毛經(jīng)DNA 測(cè)序鑒定為雙孢旱霉,一種極其罕見(jiàn)的耐旱絲狀真菌,且表面泛霜或發(fā)霉的山萸肉顏色均較深,表明泛霜和發(fā)霉的山萸肉為存儲(chǔ)時(shí)間較長(zhǎng)的陳貨。

1 材料

Triple Quad 5500 液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)AB SCIEX公司)；LC-2030C 3D 高效液相色譜儀(ELSD-LTⅡ檢測(cè)器,日本島津公司)；BX53 生物顯微鏡、SZX16 體視顯微鏡 (日 本 Olympus 公 司)；BSA224S-CW 電子天平 (德國(guó)Sartrious 公司)；XS105DU 電子天平 (上海梅特勒-托利多有限公司)。

實(shí)驗(yàn)樣品為2019 年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種山茱萸(包括山萸肉和酒萸肉2 種飲片),經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院劉亞蓉主任藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉,其中山萸肉飲片156 批。山茱萸對(duì)照藥材(批號(hào)121495-200401)、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào) 110833-201506)、果糖對(duì)照品 (批號(hào)100231-201305)、蔗糖對(duì)照品 (批號(hào) 111507-201303) 均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 山萸肉性狀研究 本研究建立了山萸肉的性狀等級(jí)劃分方法,按照飲片顏色、大小、光澤、雜質(zhì)進(jìn)行等級(jí)劃分,共劃分4 個(gè)等級(jí)。從1 級(jí)到4級(jí),山萸肉逐漸變小,顏色從紫紅色到紫黑色或黑色,光澤從有到無(wú),雜質(zhì)從少到多。經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn),山萸肉的顏色隨著存放時(shí)間的加長(zhǎng)逐漸加深,從紫紅色逐漸過(guò)渡到紫黑色或黑色。經(jīng)對(duì)156 批山萸肉進(jìn)行性狀鑒別劃分,一等品12 批,占總量的7.7%；二等品34 批,占總量的21.8%；三等品59 批,占總量的37.8%；四等品51 批,占總量的32.7%。山萸肉等級(jí)劃規(guī)則分見(jiàn)表1,性狀見(jiàn)圖1。

表1 山萸肉性狀等級(jí)劃分規(guī)則Tab.1 Grading rules for characteristics of C.officinalis

圖1 山萸肉性狀（4 個(gè)等級(jí)）Fig.1 Characteristics of C.officinalis （four levels）

對(duì)156 批山萸肉飲片性狀進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),23 批樣品表面有一層白色物質(zhì)。山萸肉飲片表面泛霜和發(fā)霉,在性狀鑒別時(shí)難以直觀判斷出白色物質(zhì)是白霜還是發(fā)霉產(chǎn)生的白毛,外觀基本一致,見(jiàn)圖2。

圖2 山萸肉表面泛霜和發(fā)霉Fig.2 White frost and mold on the surface of C.officinalis

2.2 山萸肉表面白霜研究 有書(shū)籍記載山萸肉有摻白礬現(xiàn)象,性狀與正品類似,唯表面明顯有白霜狀物[14],經(jīng)鋁鹽的相關(guān)理化實(shí)驗(yàn)研究證明,該白霜并非白礬。還有文獻(xiàn)報(bào)道,果實(shí)類經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存表面會(huì)生出一層白霜,為糖類成分。對(duì)白霜首先進(jìn)行了糖的理化實(shí)驗(yàn),結(jié)果呈陽(yáng)性,再在體視顯微鏡和生物顯微鏡下進(jìn)行研究,接著在液質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行糖的種類驗(yàn)證[15-18],最后使用HPLC-ELSD 和氨基柱進(jìn)行色譜峰分離,并與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),經(jīng)證實(shí)山萸肉表面的白霜成分主要為果糖、葡萄糖和蔗糖。

2.2.1 糖的理化反應(yīng)(α-萘酚反應(yīng)) 稱取未經(jīng)任何處理的山萸肉2 g 置于試管中,加入超純水10 mL,振搖試管5 下,使表面白色物質(zhì)溶解于超純水,立即過(guò)濾,濾液倒入另一試管中,作為供試品溶液。以超純水為空白,在空白溶液和樣品溶液中分別加入2 滴Molisch 試劑,充分混合,斜執(zhí)試管,沿壁慢慢加入濃硫酸1 mL,慢慢立起試管,切勿搖動(dòng)。濃硫酸在試液下形成2 層。供試品溶液的試管中,在二液分界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn),表明α-萘酚反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng),試液中含糖,結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 山萸肉表面白霜的糖反應(yīng)（陽(yáng)性）Fig.3 Sugar reactions of white frost on the surface of C.officinalis （positive）

2.2.2 體視顯微鏡下觀察白霜 將表面有白色物質(zhì)的山萸肉樣品置于體視顯微鏡下觀察,可見(jiàn)大量白色晶體。將表面有白霜的山萸肉在水中潤(rùn)濕一下,立即取出,自然晾干,再置體視顯微鏡下觀察,可見(jiàn)表面的白霜已無(wú),山萸肉表面紅潤(rùn)光澤(糖易溶于水的性質(zhì)),見(jiàn)圖4。

2.2.3 生物顯微鏡下觀察白霜 將山萸肉樣品表面的白霜用刀片輕輕刮下來(lái),置于載玻片上,勿加蓋玻片,置生物顯微鏡下觀察,可見(jiàn)大量無(wú)色透明晶體,偏光鏡下具白色光澤,見(jiàn)圖5。

圖4 山萸肉表面的白霜（體視顯微鏡）Fig.4 White frost on the surfaces of C.officinalis （stereomicroscope）

圖5 山萸肉表面白霜（生物顯微鏡）Fig.5 White frost on the surfaces of C.officinalis （biological microscope）

2.2.4 液質(zhì)聯(lián)用法驗(yàn)證糖的種類

2.2.4.1 分析條件 Shim-pack XR-ODS 色譜柱(2.0 mm ×100 mm,2.2 μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸(75∶25)；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。采用電噴霧離子源；負(fù)離子模式掃描；MRM模式采集。對(duì)色譜峰進(jìn)行峰確認(rèn),篩選出樣品溶液中含有果糖、葡萄糖和蔗糖,質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Parameters of mass spectrometry

2.2.4.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖對(duì)照品,加水制成質(zhì)量濃度為1 ng/mL,即得。

2.2.4.3 供試品溶液制備 取表面有白霜的山萸肉1 g,置錐形瓶中,加10 mL 超純水振搖5 下,立即過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4.4 測(cè)定條件 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL,在“2.2.4.1” 項(xiàng)條件下測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.2.4.5 測(cè)定結(jié)果 樣品溶液中含有果糖、葡萄糖和蔗糖,葡萄糖和果糖的分子離子、子離子一樣,色譜峰出峰時(shí)間一致,C18色譜柱無(wú)法將葡萄糖和果糖分離,故考慮采用HPLC-ELSD 和氨基柱將兩者分離。

圖6 各樣品MRM 質(zhì)譜圖Fig.6 MRM mass spectra of various samples

2.2.5 HPLC-ELSD 驗(yàn)證糖的種類

2.2.5.1 色譜條件 Agilent ZORBAX NH2色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水(75∶25)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器溫度40 ℃。

2.2.5.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖對(duì)照品,加水制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,即得。

2.2.5.3 供試品溶液制備 取表面有白霜的山萸肉1 g,置錐形瓶中,加10 mL 超純水振搖5 下使白色物質(zhì)溶解,立即濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2.5.4 測(cè)定條件 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各10 μL,在“2.2.5.1” 項(xiàng)條件下測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.2.5.5 測(cè)定結(jié)果 樣品溶液中檢出葡萄糖、果糖和蔗糖,其中葡萄糖和果糖含有量較高,蔗糖含有量較低。

圖7 各成分HPLC-ELSD 圖Fig.7 HPLC-ELSD chromatograms of various constituents

2.3 山萸肉表面霉菌的研究 對(duì)156 批山萸肉飲片性狀進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),3 批樣品表面有大量白毛,疑似發(fā)霉現(xiàn)象。將其置體視顯微鏡下觀察,可見(jiàn)大量毛狀物纏繞著山萸肉果實(shí)體,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法處理,但仍有大量白毛,表明它不同于之前的白霜,難溶于水,附著果實(shí)體表面較結(jié)實(shí),見(jiàn)圖8。

將山萸肉表面的白毛用刀片輕輕刮下,置于載玻片上(不加蓋玻片),置生物顯微鏡下觀察,可見(jiàn)大量孢子或菌絲團(tuán)塊。將3 批表面疑似發(fā)霉的樣品送至菌種鑒定單位進(jìn)行細(xì)菌和真菌的篩查鑒定,結(jié)果為雙孢旱霉,它是一種罕見(jiàn)的耐旱絲狀真菌,極度耐干,有水分時(shí)生長(zhǎng)更快。

圖8 山萸肉表面發(fā)霉Fig.8 Mold on the surfaces of C.officinalis

3 討論

本研究樣品為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種山茱萸(山萸肉飲片156 批,酒萸肉飲片75 批),樣品來(lái)自全國(guó)31 個(gè)省(區(qū)、市),地域覆蓋率91.2%。其中山萸肉來(lái)源于藥品經(jīng)營(yíng)企業(yè)61 批,占39.1%；生產(chǎn)企業(yè)46 批,占29.5%；使用單位49 批,占31.4%。對(duì)156 批山萸肉飲片進(jìn)行性狀研究,并建立了性狀等級(jí)劃分方法,按照飲片大小、色澤、光澤、雜質(zhì)進(jìn)行等級(jí)劃分,共劃分4 個(gè)等級(jí)。從1 級(jí)到4 級(jí),山萸肉大小逐漸變小,顏色從紫紅色到紫黑色或黑色,光澤從有到無(wú),雜質(zhì)從少到多。性狀等級(jí)劃分方法參考了中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的《中藥材商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)匯編》[19],該標(biāo)準(zhǔn)也將山萸肉劃分為4 個(gè)等級(jí),劃分4 個(gè)等級(jí)的主要區(qū)別點(diǎn)為每千克中鮮紅色、暗紅色、紅褐色、紫黑色所占比例,以及雜質(zhì)的多少。本研究建立的等級(jí)劃分依據(jù)是顏色、大小、光澤度和雜質(zhì),4 個(gè)等級(jí)的表面顏色從紫紅色到紫黑色或黑色(增加了黑色),顏色的變化經(jīng)本課題穩(wěn)定性試驗(yàn)佐證,即山萸肉的顏色隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加深,也說(shuō)明陳貨的顏色較深。研究中發(fā)現(xiàn)山萸肉的大小差別明顯,列入劃分依據(jù),色澤也是性狀的一個(gè)主要鑒別點(diǎn),一等品色澤光亮,而二、三和四等品色澤逐漸消失,色澤亦列入劃分依據(jù)。

經(jīng)對(duì)156 批山萸肉性狀研究,發(fā)現(xiàn)23 批山萸肉表面具有一層白色物質(zhì),可區(qū)分為泛霜或發(fā)霉,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析,表面泛霜的原因是山萸肉為果實(shí)類中藥材,含有糖類成分,經(jīng)長(zhǎng)期放置,表面析出糖類成分,表面光澤消失,且泛霜山萸肉顏色均較深,這與穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果一致,即山萸肉的表面顏色隨著飲片儲(chǔ)存年限的增長(zhǎng),由紫紅色變?yōu)楹谏?逐漸加深,表面逐漸失去光澤。表面發(fā)霉的原因可能是儲(chǔ)存不當(dāng),環(huán)境濕度過(guò)大,3 批鑒定為發(fā)霉山萸肉,經(jīng)測(cè)定水分超過(guò)2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的限度,因此建議山茱萸應(yīng)儲(chǔ)存在通風(fēng)干燥的環(huán)境中。