蘋果小吉丁蟲對(duì)病蟲害誘導(dǎo)野蘋果樹揮發(fā)物觸角電位和行為反應(yīng)

劉愛華，孔婷婷，張靜文，溫俊寶，焦淑萍

（1.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083；2.新疆林業(yè)科學(xué)院 森林生態(tài)研究所，新疆 烏魯木齊 830063）

蘋果小吉丁蟲Agrilusmali屬鞘翅目Coleoptera吉丁蟲科Buprestidae，是薔薇科Rosaceae蘋果屬M(fèi)alus果樹一種重要蛀干害蟲。其幼蟲在枝干皮層內(nèi)蛀食，破壞水分和養(yǎng)分輸導(dǎo)組織，導(dǎo)致枝條枯死，危害嚴(yán)重時(shí)造成果樹整株枯死。2013年，蘋果小吉丁蟲被列為全國林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物。1999年，蘋果小吉丁蟲在新疆天山伊犁河谷野果林中被發(fā)現(xiàn)暴發(fā)成災(zāi)[1]，伊犁野果林中最主要的建群種為新疆野蘋果Malussieversii，又名塞威氏蘋果，為中國珍稀瀕危二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[2?4]。近20 a來，因蘋果小吉丁蟲、蘋果腐爛病菌Valsamali等有害生物危害，導(dǎo)致新疆伊犁河谷野蘋果林持續(xù)衰退。由于蘋果小吉丁蟲危害具有隱蔽性，蟲態(tài)發(fā)育不整齊，加之野蘋果分布區(qū)地形復(fù)雜，常規(guī)的防治方法很難操作，且效果不佳。蘋果小吉丁蟲現(xiàn)有監(jiān)測方法主要是采用設(shè)置固定樣地，進(jìn)行人工剝樹皮統(tǒng)計(jì)蟲口密度，費(fèi)工費(fèi)時(shí)。因此，探索可操作性和效果更佳的防治與監(jiān)測方法，是當(dāng)前迫切需要解決的問題。開發(fā)植物源性引誘劑，是開展野蘋果林蘋果小吉丁蟲監(jiān)測與防治的新策略。外界條件作用誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生的揮發(fā)物，在昆蟲化學(xué)通信中發(fā)揮著重要作用，能影響植食性昆蟲尋找和選擇寄主、取食、產(chǎn)卵等多種生理過程[5?7]。同時(shí)，寄主植物揮發(fā)物在植物間接產(chǎn)生防御過程中，可能也充當(dāng)重要角色[8?9]。已有眾多研究報(bào)道，由于蟲害誘導(dǎo)導(dǎo)致植物揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生變化[10?12]。與健康植株相比，被植食性昆蟲取食或產(chǎn)卵危害后，植株釋放的揮發(fā)物在種類和含量上都有很大差異[13?15]。一般植物受害后揮發(fā)物的種類會(huì)增加，揮發(fā)性物質(zhì)釋放量往往高于受害前，因此更容易被植食性昆蟲遠(yuǎn)距離識(shí)別[16?17]。榆樹Ulmuspumila在受榆紫葉甲Ambrostomaquadriimpressum成蟲取食危害后，9 種物質(zhì)的含量與健康植株相比有顯著差異，經(jīng)觸角電位和行為反應(yīng)測定，其中α-法尼烯、芳樟醇、順-3-己烯醇、石竹烯對(duì)榆紫葉甲雌雄成蟲具有引誘活性[18]。受白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis危害的水曲柳Fraxinusmandshurica釋放的揮發(fā)物對(duì)白蠟窄吉丁雌成蟲具有顯著引誘作用，雌成蟲對(duì)芳樟醇的觸角電位(electroantennogram, EAG)反應(yīng)值要大于雄成蟲，而雄成蟲對(duì)己醛、(E)-2-己烯醛、順-3-己烯醇、3-甲基丁醛肟、2-甲基丁醛肟和乙酸己酯EAG反應(yīng)值要大于雌成蟲[8]。目前，國內(nèi)外眾多研究人員先后研究昆蟲與植物之間化學(xué)通信關(guān)系，解析了昆蟲與植物互作機(jī)制，研究出害蟲監(jiān)測與防控技術(shù)措施。王明等[19]研究發(fā)現(xiàn)：機(jī)械損傷、茉莉酸甲酯處理及害蟲處理等外界因素會(huì)導(dǎo)致新疆野蘋果樹體內(nèi)揮發(fā)性化合物組分，在含量和種類上發(fā)生明顯改變。在野果林中，蘋果小吉丁蟲與寄主野蘋果化學(xué)通信關(guān)系研究尚不完善。本研究探討病蟲害危害誘導(dǎo)野蘋果產(chǎn)生揮發(fā)物對(duì)蘋果小吉丁蟲嗅覺與行為反應(yīng)的影響，以期篩選出對(duì)蘋果小吉丁蟲具有引誘作用的植物源引誘劑，為蘋果小吉丁蟲防治與監(jiān)測工作提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣地概況 樣地位于新疆維吾爾自治區(qū)新源縣阿勒瑪勒鄉(xiāng)、鞏留縣庫爾德寧鎮(zhèn)野蘋果林中。阿勒瑪勒鄉(xiāng)調(diào)查樣地海拔1 296.0～1 395.0 m，氣候濕潤，冬暖夏涼，年平均氣溫7.7 ℃，1月平均氣溫?8.1 ℃，7月平均氣溫20.4 ℃，降水量580 mm，冬季積雪厚度約1.0 m。冬季逆溫現(xiàn)象明顯。土壤為山地黑棕色野果林土類，具有優(yōu)越的自然生態(tài)條件。植被以野蘋果為主，樹齡30～55 a，樹高6～12 m，胸徑17～28 cm，調(diào)查樣地總面積在6.7 hm2以上。庫爾德寧鎮(zhèn)調(diào)查樣地海拔1 237.0～1 380.0 m，全年平均氣溫7.4 ℃，最高氣溫37.0～39.0 ℃，極端最低氣溫?36.0～?38.0 ℃，無霜期150 d左右，年降水量200～780 mm。植被以野蘋果為主，樹齡25～40 a，樹高3～12 m，胸徑8～35 cm，調(diào)查樣地總面積在10 hm2以上。其中健康樹選在新源縣野果林資源圃，蘋果小吉丁蟲危害樹選在72團(tuán)8連，蘋果腐爛病菌危害樹選在新源縣野果林資源圃。供試?yán)ハx：從新疆維吾爾自治區(qū)新源縣、鞏留縣野蘋果林中，采集受蘋果小吉丁蟲危害野果林枝條帶回室內(nèi)，罩籠自然羽化獲得。

1.1.2 材料 TA吸附管(珀金埃爾默股份有限公司，美國)，玻璃干燥塔，活性炭，烤箱袋(雷諾茲消費(fèi)品公司，美國)，硅膠管。

1.1.3 儀器設(shè)備 QC-1B氣體采樣儀(北京市勞動(dòng)保護(hù)研究所)，TurboMatrix 650全自動(dòng)熱脫附儀(珀金埃爾默股份有限公司, 美國)，7890A Network氣相色譜/5975C Network質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司,美國)，配有NIST 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司，美國)。觸角電位儀(Electroantennogram，EAG)由荷蘭Syntech公司生產(chǎn)，主要包括MP-15微動(dòng)操作臺(tái)(Syntech公司，荷蘭)，CS-55刺激控制器(Syntech公司，荷蘭)，IDAC-4數(shù)據(jù)采集控制器(Syntech公司，荷蘭)，配有EAGPro軟件，PSM4-150四臂嗅覺儀(南京普森儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.4 試劑 液體石蠟(西隴科學(xué)股份有限公司)，觸角電位測試標(biāo)準(zhǔn)品見表1。

表 1 觸角電位測定實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)化合物純度及來源Table 1 Source and purity of standard chemicals used in EAG testing

1.2 方法

1.2.1 野蘋果揮發(fā)物采集 動(dòng)態(tài)頂空采樣法氣路連接方法：首先在采集袋上下斜對(duì)角開2個(gè)小孔，與硅膠管相連接，并用膠帶纏緊。將待測野蘋果枝條用采集袋籠罩，釆集袋封口處與待測枝條捆綁處鋪墊1層脫脂棉，并用棉線繩捆嚴(yán)實(shí)。先利用大氣采樣儀將袋內(nèi)存余空氣抽干。用硅膠管將玻璃干燥塔(內(nèi)裝活性炭)一端與采集袋下口硅膠管相連，另一端與大氣采樣儀出氣口相連。然后用大氣采樣儀經(jīng)玻璃干燥塔將采集袋充氣充滿。按照吸附管氣流箭頭方向，使用硅膠管將吸附管與采集袋相連，并與大氣采樣儀進(jìn)氣口端相連，形成閉合回路。對(duì)待測枝條以100 mL·min?1的速率進(jìn)行抽提采樣。采樣時(shí)間持續(xù)30 min。將直徑為3～5 cm的枝干，截為30 cm木段，將4根木段放入采集袋內(nèi)，采用同樣的方法搜集枝干揮發(fā)物。分別收集健康樹、蘋果小吉丁蟲危害、蘋果腐爛病菌危害樹枝條和枝干揮發(fā)物，以空白作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次[20]。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析測試吸附管內(nèi)寄主揮發(fā)物成分。

1.2.2 ATD-GC/MS分析條件 全自動(dòng)熱脫附儀(Auto Thermal Desorber, ATD)工作條件：一級(jí)熱脫附溫度260 ℃，冷阱溫度為?30 ℃，保持3 min。二級(jí)冷阱溫度為300 ℃，保持5 min，四通閥溫度230 ℃，傳輸線250 ℃。氣譜條件：DB-5ms色譜柱毛細(xì)柱 (60 m × 0.25 mm×0.25 μm，安捷倫科技有限公司，美國); 升溫程序: 40 ℃ 保持 2 min，以 6 ℃·min?1升至 130 ℃，再以 8 ℃·min?1升至 280 ℃ 保持 5 min。載氣為氦氣，流速0.4 mL·min?1。進(jìn)樣器溫度250 ℃；分流比為10∶1進(jìn)樣。以色譜峰保留時(shí)間定性，以峰面積相對(duì)定量計(jì)算。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃。掃描質(zhì)荷比范圍(m/z) 45～500。

1.2.3 蘋果小吉丁蟲對(duì)野蘋果揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng) 將蘋果小吉丁蟲的頭剪下，并將鞭節(jié)第9末節(jié)頂端用導(dǎo)電膠(Spectra 360, 美國派克實(shí)驗(yàn)室公司)固定于“Y”形金屬電極測定電極上，頭部連接參比電極。電極插入微動(dòng)操作臺(tái)探頭內(nèi)并連接Syntech數(shù)據(jù)采集接口板(Type IDAC-4)；同時(shí)連接計(jì)算機(jī)通過EAGPro軟件記錄測定值。通過分析測定，篩選出13個(gè)主要寄主揮發(fā)物，選取標(biāo)樣，由液體石蠟溶解稀釋為 10?1、10?2、10?3、10?4、10?5和 10?6g·g?16 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度。將一小片濾紙 4 折成長方形，并放入巴斯德管基部，在濾紙上滴20 μL待測化學(xué)標(biāo)樣，并等待其被濾紙完全吸收。以10?3g·g?1的順-3-己烯醇作為標(biāo)準(zhǔn)刺激物，液體石蠟的刺激作為對(duì)照組對(duì)觸角進(jìn)行刺激。每次刺激時(shí)，將巴斯德管端部接入由CS-55刺激控制器產(chǎn)生的每次持續(xù)1 s的刺激氣流氣路管，使得刺激氣流在混合管中與正常氣流混合，作用于觸角。每種物質(zhì)的每輪質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度EAG刺激試驗(yàn)按以下順序進(jìn)行：液體石蠟、標(biāo)準(zhǔn)物的刺激、10?6～10?1g·g?1的標(biāo)樣、標(biāo)準(zhǔn)物的刺激、液體石蠟。每次刺激之間，觸角有1 min的時(shí)間間隔來恢復(fù)。每種物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度EAG分別在雌雄成蟲觸角測試，且至少重復(fù)5次。為準(zhǔn)確量化EAG反應(yīng)，每次刺激選取觸角產(chǎn)生的第1個(gè)反應(yīng)峰值作為有效值[20]。

1.2.4 蘋果小吉丁蟲對(duì)寄主野蘋果揮發(fā)性物質(zhì)的行為反應(yīng) 使用試驗(yàn)中相同的揮發(fā)物標(biāo)樣，溶于液體石蠟中，以10?1g·g?1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)用于測定蘋果小吉丁蟲對(duì)野蘋果樹的揮發(fā)物的行為選擇。使用4臂嗅覺儀作為行為測定儀。在每臂的端部各連接1個(gè)梨形玻璃瓶陷阱，瓶內(nèi)隨機(jī)放入浸潤待測標(biāo)樣或液體石蠟的濾紙，其中選擇1個(gè)梨形玻璃瓶陷阱作為測試處理瓶，其余3個(gè)作為對(duì)照瓶。梨形瓶另一端連接水過濾的空氣、空氣流量計(jì)與活性炭。4臂中均勻一致地持續(xù)通過流速為200 mL·min?1氣體。在嗅覺儀中央放入1只饑餓24 h蘋果小吉丁蟲，穩(wěn)定后開始計(jì)時(shí)，每次試驗(yàn)持續(xù)觀察15 min。當(dāng)蘋果小吉丁蟲進(jìn)入陷阱或走入梨形瓶口的位置則記為有效反應(yīng)，其余則記為無反應(yīng)。每次試驗(yàn)完成后，將蘋果小吉丁蟲從嗅覺儀中移走，將刺激源移走，并將行為儀空吹再進(jìn)行下1個(gè)重復(fù)；每個(gè)重復(fù)測定結(jié)束后，用無水乙醇擦拭測試區(qū)及梨形瓶，并將擦拭過梨形瓶放入180 ℃烘箱中，15 min干燥清潔。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在試驗(yàn)室條件下進(jìn)行：溫度為24～26 ℃，相對(duì)濕度為40%±10%。每種揮發(fā)物標(biāo)樣分別測試雌雄成蟲各20只，重復(fù)3次，計(jì)算反應(yīng)率、選擇反應(yīng)率和選擇系數(shù)[21]。反應(yīng)率=(味源管中蟲數(shù)+對(duì)照管中蟲數(shù))/測試總蟲數(shù)×100%。選擇反應(yīng)率=味源臂試蟲數(shù)/(味源臂試蟲數(shù)+對(duì)照臂試蟲數(shù))×100%。選擇系數(shù)=(味源管中蟲數(shù)?對(duì)照管中蟲數(shù))/(味源管中蟲數(shù)+對(duì)照管中蟲數(shù))。其中：選擇系數(shù)大于0，表示試蟲對(duì)味源物質(zhì)有趨性，數(shù)值越大，表示趨性越強(qiáng)，最大值為1；選擇系數(shù)若小于0，則表示試蟲對(duì)味源有負(fù)趨性(即忌避性)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 ①野蘋果揮發(fā)物數(shù)據(jù)處理方法。譜圖檢索及成分鑒定由ATD-GC/MS操作得到各樣品的質(zhì)譜相對(duì)豐度圖及總離子流圖(total ion current，TIC)。對(duì) TIC 圖中各有效峰代表的化學(xué)信息，利用專業(yè)檢索軟件TurboMass 5.4.2和標(biāo)準(zhǔn)譜庫 NIST05，結(jié)合經(jīng)典氣相色譜保留時(shí)間數(shù)據(jù)和相關(guān)化學(xué)經(jīng)驗(yàn)，鑒定野蘋果枝條和枝干揮發(fā)物組分中的化學(xué)成分，并用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物在總揮發(fā)性組分中的相對(duì)百分含量。②觸角電位計(jì)算方法。每個(gè)重復(fù)內(nèi)的EAG反應(yīng)值計(jì)算公式如下：R=(T?C)/(D?C)，其中：R為蘋果小吉丁蟲觸角對(duì)樣品EAG反應(yīng)相對(duì)值，T為單次待測標(biāo)樣所測得的EAG反應(yīng)值(mV)，C為同一待測標(biāo)樣該輪內(nèi)對(duì)照組液體石蠟2次所測得的EAG反應(yīng)值的平均值(mV)，D為同一待測標(biāo)樣該輪內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物2次所測得的EAG反應(yīng)值的平均值(mV)[20]。

不同物質(zhì)、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的EAG反應(yīng)值由雙因素方差分析(Two-way ANOVA)以及多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算和對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同危害條件下野蘋果枝條釋放主要揮發(fā)物成分及相對(duì)含量

收集不同危害條件下野蘋果枝條主要揮發(fā)物，利用GC-MS分析鑒定，共搜集到揮發(fā)性化合物31種，其中從健康植株枝條中搜集到揮發(fā)物14種，從蘋果小吉丁蟲危害枝條中搜集到揮發(fā)物24種，從蘋果腐爛病菌危害枝條中搜集到揮發(fā)物21種。搜集到的31種揮發(fā)物可分為8類，包括醇類2種，脂類5種，醛類7種，烷烴類10種，烯烴類1種，酮類2種，萜類3種，其他類1種(表2)。

健康植株枝條特有的揮發(fā)物有3種，分別為青葉醛、二十四烷、環(huán)庚烷。蘋果小吉丁蟲危害枝條特有揮發(fā)物有5種，分別為順-3-己烯醛、癸醛、壬醛、2,4,4-三甲基-己烷、2,4-二甲基庚烷。蘋果腐爛病菌危害枝條特有揮發(fā)物有3種，分別為丙烯酸丁酯、苯乙酮、(+)-α蒎烯。在健康樹枝條和受蘋果小吉丁蟲危害枝條共有，而受蘋果腐爛病菌危害枝條中沒有采集到的揮發(fā)物有2種，分別為丁烯醇、2-甲基丙烯醛。在健康樹枝條和受蘋果腐爛病菌危害枝條共有，而受蘋果小吉丁蟲危害枝條沒有采集到揮發(fā)物有1種，為3,7-二甲基癸烷。在受蘋果小吉丁蟲和蘋果腐爛病菌危害枝條共有，而健康枝條中沒有采集到揮發(fā)物有9 種，分別為順-3-己烯醇、丙酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、丁酸丁酯、己醛、苯甲醛、2-甲基庚烷、(+)-檸檬烯。3種危害條件下野蘋果枝條共有揮發(fā)物為8種，分別為十五烷、十七烷、二十烷、二十一烷、環(huán)庚三烯、環(huán)己酮、α-蒎烯、甘菊藍(lán)。

從揮發(fā)物相對(duì)含量可以看出：3種處理之間揮發(fā)物相對(duì)含量存在顯著差異。與健康植株枝條相比，受蘋果小吉丁蟲危害枝條釋放的揮發(fā)物種類增加的為順-3-己烯醇、丙酸丁酯、丁酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、順-3-己烯醛、己醛、癸醛、壬醛、苯甲醛、2-甲基庚烷、2,4,4-三甲基-己烷、2,4-二甲基庚烷、(+)-檸檬烯等14種化合物，十五烷、二十烷相對(duì)含量增加，丁烯醇、2-甲基丙烯醛、十七烷、二十一烷、環(huán)庚三烯、環(huán)己酮、α-蒎烯、甘菊藍(lán)等8種揮發(fā)物有所降低，青葉醛、3,7-二甲基癸烷、二十四烷、環(huán)庚烷未采集到。受蘋果腐爛病菌危害枝條揮發(fā)物種類增加的為順-3-己烯醇、丙酸丁酯、丁酸丁酯、丙烯酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、己醛、苯甲醛、2-甲基庚烷、苯乙酮、(+)-α蒎烯、(+)-檸檬烯等12種揮發(fā)物，十五烷、十七烷、3,7-二甲基癸烷，二十烷、α-蒎烯相對(duì)含量增加，二十一烷、環(huán)己酮、環(huán)庚三烯、甘菊藍(lán)減少，丁烯醇、2-甲基丙烯醛、青葉醛、二十四烷、環(huán)庚烷未采集到?？傮w上，與健康樹枝條揮發(fā)物種類和相對(duì)含量相比較，受蘋果小吉丁蟲和蘋果腐爛病菌危害枝條揮發(fā)物種類增加的為順-3-己烯醇、丙酸丁酯、丁酸丁酯、丙烯酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、順-3-己烯醛、己醛、癸醛、壬醛、苯甲醛、2-甲基庚烷、2,4,4-三甲基-己烷、2,4-二甲基庚烷、苯乙酮、(+)-α蒎烯、(+)-檸檬烯等。

2.2 不同危害條件下野蘋果枝干主要揮發(fā)物成分及相對(duì)含量

收集不同危害條件下野蘋果枝干主要揮發(fā)物，并進(jìn)行GC-MS分析鑒定。共搜集到揮發(fā)性化合物32種，其中從健康植株枝干中搜集到揮發(fā)物12種，從蘋果小吉丁蟲危害枝干中搜集到揮發(fā)物25種，從蘋果腐爛病菌危害枝干中搜集到揮發(fā)物19種。搜集到的32種揮發(fā)物可分為9類，包括醇類3種，脂類7種，醛類6種，烷烴類3種，烯烴類1種，酮類2種，萜類7種，醚類2種，其他類1種(表2)。

健康植株枝干特有的揮發(fā)物有2種，分別為(+)-檸檬烯、仲丁醚。蘋果小吉丁蟲危害枝干特有揮發(fā)物有10種，分別為1-戊烯-3-醇、順-2-己烯-1-醇、丁酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、2-甲基丁酸乙酯、癸醛、2-甲基-2-戊烯醛、2-癸酮、(+)-香橙烯。蘋果腐爛病菌危害枝干特有揮發(fā)物有4種，分別為丙酸丁酯、丙烯酸丁酯、順-3-己烯醛、雙戊烯。健康樹枝干和受蘋果小吉丁蟲危害枝干共有，而受蘋果腐爛病菌危害枝干中沒有采集到的揮發(fā)物有2種，分別為環(huán)庚三烯、莰烯。在健康樹枝干和受蘋果腐爛病菌危害枝干共有，而受蘋果小吉丁蟲危害枝干中沒有采集到的揮發(fā)物有2種，分別為丙烯醛、環(huán)己酮。受蘋果小吉丁蟲危害枝干和受蘋果腐爛病菌危害枝干共有，而健康樹枝條沒有采集到的揮發(fā)物有7種，分別為3-辛烯-2-醇、丁酸烯丙酯、苯甲醛、十五烷、十七烷、二十烷、苯甲醚。3種危害條件下野蘋果枝干共有揮發(fā)物為6種，分別為順-3-己烯醇、己醛、α-蒎烯、(?)-α-蒎烯、β-蒎烯、甘菊藍(lán)。

表 2 不同危害條件下野蘋果枝條和枝干主要揮發(fā)物成分及相對(duì)含量Table 2 Composition and relative contents of main volatiles released from the branch and limb of the wild apple in different damaged states

3種處理之間野蘋果枝干揮發(fā)物相對(duì)含量存在顯著差異。與健康植株枝干釋放的揮發(fā)物相比，受蘋果小吉丁蟲危害枝干釋放的揮發(fā)物種類增加的為1-戊烯-3-醇、順-2-己烯-1-醇、3-辛烯-2-醇、丁酸丁酯、梨醇酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸烯丙酯、乙酸葉醇酯、癸醛、苯甲醛、2-甲基-2-戊烯醛、十五烷、十七烷、二十烷、2-癸酮、(+)-香橙烯、苯甲醚；順-3-己烯醇、α-蒎烯、(?)-α-蒎烯、莰烯相對(duì)含量增加，己醛、環(huán)庚三烯、β-蒎烯、甘菊藍(lán)相對(duì)含量有所降低，丙烯醛、環(huán)己酮、(+)-檸檬烯、仲丁醚未采集到。受蘋果腐爛病菌危害枝干種類增加的為3-辛烯-2-醇、丙酸丁酯、丙烯酸丁酯、丁酸烯丙酯、順-3-己烯醛、苯甲醛、十五烷、十七烷、二十烷、雙戊烯、苯甲醚等11種化合物，己醛相對(duì)含量增加，順-3-己烯醇、丙烯醛、環(huán)己酮、α-蒎烯、(?)-α-蒎烯、β-蒎烯、甘菊藍(lán)相對(duì)含量降低?？傮w上，與健康樹枝干揮發(fā)物種類和相對(duì)含量相比較，受蘋果小吉丁蟲和蘋果腐爛病菌危害枝干揮發(fā)物種類增加的為1-戊烯-3-醇、順-2-己烯-1-醇、3-辛烯-2-醇、丙酸丁酯、丁酸丁酯、丙烯酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸烯丙酯、順-3-己烯醛、癸醛、苯甲醛、2-甲基-2-戊烯醛、十五烷、十七烷、二十烷、2-癸酮、雙戊烯、(+)-香橙烯、苯甲醚等21種。

2.3 不同危害條件下野蘋果枝條與枝干主要揮發(fā)物成分及相對(duì)含量比較

不同危害條件下野蘋果枝條與枝干主要揮發(fā)物成分種類不同。健康野蘋果枝條和健康野蘋果枝干共有的揮發(fā)物3種，分別為環(huán)庚三烯、α-蒎烯、甘菊藍(lán)。蘋果小吉丁蟲危害野蘋果枝條及危害枝干共有揮發(fā)物13種，分別順-3-己烯醇、丁酸丁酯、梨醇酯、乙酸葉醇酯、己醛、癸醛、苯甲醛、十五烷、十七烷、二十烷、環(huán)庚三烯、α-蒎烯、甘菊藍(lán)。由表2可以看出：受蘋果小吉丁蟲危害的枝干揮發(fā)物中，順-3-己烯醇、丁酸丁脂、梨醇酯、乙酸葉醇酯、癸醛、苯甲醛、十七烷、α-蒎烯等相對(duì)含量要高于受蘋果小吉丁蟲危害枝條揮發(fā)物相對(duì)含量。

蘋果腐爛病菌危害的枝條和蘋果腐爛病菌危害的枝干共有揮發(fā)物為11種，分別為順-3-己烯醇、丙酸丁酯、丙烯酸丁酯、己醛、苯甲醛、十五烷、十七烷、二十烷、環(huán)己酮、α-蒎烯、甘菊藍(lán)。由表2可以看出：蘋果腐爛病菌危害的枝條和蘋果腐爛病菌危害的枝干共有揮發(fā)物相對(duì)含量丙酸丁酯、丙烯酸丁酯、己醛、苯甲醛、十五烷、α-蒎烯等6種差異較大外，其他幾種揮發(fā)物相對(duì)含量差別不大。

2.4 蘋果小吉丁蟲對(duì)寄主植物揮發(fā)物標(biāo)樣觸角電位反應(yīng)

13種寄主揮發(fā)物標(biāo)樣在10?1g·g?1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，刺激蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲觸角，均產(chǎn)生較大的EAG反應(yīng)值，其中雌蟲觸角對(duì)壬醛產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值最大，且與(+)-檸檬烯差異顯著；雄蟲觸角對(duì)(?)-α-蒎烯產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值最大。雌蟲觸角對(duì)壬醛、(+)-α-蒎烯、丙烯酸丁酯、癸醛、2-甲基丙烯醛等5種化合物產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值大于雄蟲觸角所產(chǎn)生的反應(yīng)值。雄蟲觸角對(duì) (?)-α-蒎烯、α-蒎烯、(+)-β-蒎烯、苯甲醛、(+)-檸檬烯、十五烷、乙酸葉醇酯、(?)-β-蒎烯等8種化合物產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值大于雌蟲觸角所產(chǎn)生的反應(yīng)值。通過雙因素方差分析，雌雄蟲對(duì)不同化合物標(biāo)樣在在10?1g·g?1質(zhì)量分?jǐn)?shù)下產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值，差異不顯著(圖1)。

2.5 蘋果小吉丁蟲對(duì)植物揮發(fā)物標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度觸角電位反應(yīng)(EAG)

蘋果小吉丁蟲雌蟲和雄蟲對(duì)寄主揮發(fā)物標(biāo)樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10?6～10?1g·g?1范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，雌蟲和雄蟲觸角受刺激，EAG反應(yīng)值逐漸增大。不同物質(zhì)在10?1g·g?1質(zhì)量分?jǐn)?shù)下刺激蘋果小吉丁蟲雌蟲和雄蟲觸角均產(chǎn)生最大的 EAG 反應(yīng)。在 10?1g·g?1下，壬醛、(+)-α-蒎烯、(?)-α-蒎烯刺激蘋果小吉丁蟲雌蟲觸角依次產(chǎn)生較大的EAG；(?)-α-蒎烯、壬醛、苯甲醛刺激蘋果小吉丁蟲雄蟲觸角依次產(chǎn)生較大的EAG。在測定的13種植物揮發(fā)物標(biāo)樣中，α-蒎烯、壬醛刺激雄蟲觸角，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，EAG反應(yīng)具有顯著差異；其他11種物質(zhì)刺激雄蟲觸角，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，EAG反應(yīng)差異不顯著；(+)-α-蒎烯、(?)-α-蒎烯、壬醛刺激雌蟲觸角，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，EAG反應(yīng)具有顯著差異，其他10種物質(zhì)刺激雌蟲觸角，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，EAG反應(yīng)差異不顯著。

對(duì)不同物質(zhì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)EAG反應(yīng)進(jìn)行雙因素方差分析。結(jié)果顯示：雌蟲和雄蟲觸角對(duì)不同種類物質(zhì)和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)化合物所產(chǎn)生的EAG反應(yīng)具有顯著差異。13種物質(zhì)的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10?3～10?6g·g?1)刺激蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲觸角產(chǎn)生的EAG反應(yīng)差異不顯著(P＞0.05)，說明蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲觸角對(duì)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)不夠敏感。通過應(yīng)用LSD多重比較分析，蘋果小吉丁蟲雌成蟲觸角對(duì)(?)-α-蒎烯、α-蒎烯、苯甲醛、(+)-檸檬烯刺激產(chǎn)生 EAG反應(yīng)與其他9種物質(zhì)差異顯著(P＜0.05)。蘋果小吉丁蟲雄成蟲觸角對(duì)(?)-α-蒎烯刺激產(chǎn)生EAG反應(yīng)與其他13種物質(zhì)差異顯著(P＜0.05)，其EAG反應(yīng)值也相對(duì)較大。

圖 1 蘋果小吉丁蟲成蟲對(duì)寄主主要揮發(fā)物標(biāo)樣在10?1 g·g?1質(zhì)量分?jǐn)?shù)下EAG反應(yīng)Figure 1 EAG responses of adults of A.mali to synthetic monomers at dose 10?1 g·g?1

2.6 蘋果小吉丁蟲對(duì)寄主野蘋果主要揮發(fā)物的行為反應(yīng)

由表3可以看出：蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲對(duì)寄主野蘋果揮發(fā)物標(biāo)樣(-)-α-蒎烯、癸醛、壬醛、α-蒎烯反應(yīng)率、選擇反應(yīng)率顯著高于其他幾種，且選擇系數(shù)均大于0，說明蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲對(duì)這幾種揮發(fā)物標(biāo)樣具有一定的趨性。

表 3 蘋果小吉丁蟲雌雄蟲對(duì) 13 種寄主揮發(fā)物在 10?1 g·g?1 下行為反應(yīng)Table 3 Behavior orientation responses of male and female A.mali to 13 synthetic monomers at dose 10?1 g·g?1

3 結(jié)論與討論

植物能夠合成并釋放多種揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds，VOCs)。已經(jīng)有眾多研究報(bào)道，由于蟲害誘導(dǎo)導(dǎo)致植物揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生變化[12?14]。植物根、莖、葉、果實(shí)、種子均可以合成綠葉揮發(fā)物,但合成部位、組成和含量不僅與植物種類及其生態(tài)型有關(guān), 還與組織器官所處發(fā)育階段和生長季節(jié)等因素有關(guān)。植物除了在正常生理?xiàng)l件下合成綠葉揮發(fā)物外，病蟲害、有益菌定植、機(jī)械損傷、不良環(huán)境條件等因素都會(huì)影響植物綠葉揮發(fā)物的合成與釋放[22]。野蘋果枝條和枝干均能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，受蘋果小吉丁蟲危害的枝條十五烷相對(duì)含量增加。有研究顯示：十五烷對(duì)捕食性天敵擬環(huán)紋豹蛛Pardosa pseudoannulata具有引誘效果[23]。因此，十五烷可能在野蘋果樹間接防御蘋果小吉丁蟲危害中發(fā)揮一定作用。

本研究中，所選取13種寄主揮發(fā)物標(biāo)樣在10?1g·g?1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，均能引起雌雄成蟲觸角產(chǎn)生不同程度觸角電位，除(+)-α-蒎烯、丙烯酸丁酯、癸醛、2-甲基丙烯醛等5種化合物引起雌蟲觸角產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值大于雄蟲觸角所產(chǎn)生的反應(yīng)值外，其他8種寄主揮發(fā)物標(biāo)樣引起雄蟲觸角產(chǎn)生的EAG反應(yīng)值大于雌蟲。從整體來看，雄蟲對(duì)寄主揮發(fā)物EAG反應(yīng)值要大于雌蟲，這與崔曉寧[24]測試結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)：白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis雄蟲觸角比雌蟲觸角更敏感，對(duì)順-3-己烯醇的反應(yīng)最強(qiáng)，而順-3-己烯醇對(duì)白蠟窄吉丁雌雄蟲具有很強(qiáng)的誘集作用[25?26]。伊志豪[27]研究蘋果小吉丁蟲雌雄成蟲觸角感器略有差異，這可能是導(dǎo)致雄蟲對(duì)寄主揮發(fā)物EAG反應(yīng)值要大于雌蟲因素之一。

不同危害條件下野蘋果枝條與枝干揮發(fā)物種類與相對(duì)含量會(huì)發(fā)生變化。通過測定蘋果小吉丁蟲對(duì)寄主13種揮發(fā)物觸角電位和行為反應(yīng)，(?)-α-蒎烯、壬醛、癸醛對(duì)蘋果小吉丁蟲成蟲具有較好的引誘作用。今后，還可以增加待測化合物種類，以期獲得更多對(duì)蘋果小吉丁蟲成蟲具有引誘作用化合物，同時(shí)在野果林中分別測試(?)-α-蒎烯、壬醛、癸醛3種化合物在不同濃度、不同復(fù)配、不同溶劑與助劑條件下，對(duì)蘋果小吉丁蟲成蟲引誘效果，最終開發(fā)出對(duì)蘋果小吉丁蟲成蟲有效的植物源引誘劑。