光質(zhì)對不同家系青錢柳生物量和葉三萜類化合物積累的影響

劉 洋，陳 培，周明明，李 娜，方升佐,2

（1.南京林業(yè)大學 林學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210037）

青錢柳Cyclocaryapaliurus又名青錢李、搖錢樹、一串錢等，隸屬胡桃科Juglandaceae青錢柳屬Cyclocarya植物，主要分布于江蘇、浙江、貴州、廣西、江西等亞熱帶地區(qū)，為特有的單種屬多功能樹種[1]。研究表明：青錢柳葉中含有多種微量元素和黃酮類、三萜類、多糖類等活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、抗氧化和防衰老等功效[2?6]，藥用開發(fā)前景良好。目前，對于青錢柳的研究主要集中于活性物質(zhì)的提取與分離，而有關遺傳因子及環(huán)境條件對三萜類化合物積累的影響研究較少[7?8]。遺傳因子和環(huán)境條件(如水分、溫度、光強和光質(zhì)等)不僅影響植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成，還對植物的次生代謝物質(zhì)積累產(chǎn)生重大影響[9?12]。掌握光強和光質(zhì)對植物生長和次生代謝類物質(zhì)積累影響的規(guī)律，不僅有利于提高植物光能利用效率，還有利于實現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)精準高效的生產(chǎn)要求。鄧波等[13]發(fā)現(xiàn)：遮光、種源及兩者的交互作用顯著影響了青錢柳總?cè)坪腿茊误w的單株產(chǎn)量。已有研究表明：光質(zhì)和遺傳因子顯著影響了青錢柳葉黃酮類化合物的積累[14]。然而，光質(zhì)條件對青錢柳三萜類化合物積累的影響還不清楚。為了加深遺傳因子和光環(huán)境對植物三萜類化合物積累影響的認識，本研究開展了光質(zhì)對不同家系青錢柳生物量積累、葉三萜類化合物質(zhì)量分數(shù)和三萜單株產(chǎn)量影響的研究，以期為藥用青錢柳葉用林栽培中的環(huán)境調(diào)控和選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗設計

選擇4個地域性、生長及活性成分差異顯著[14](四川沐川31號、浙江安吉1號、廣西金鐘山6號、廣西金鐘山7號)的青錢柳家系種子獲得實生幼苗，幼苗在南京市白馬教學試驗基地培養(yǎng)。2016年5月下旬，選取1年生、生長狀況良好、長勢一致的青錢柳幼苗(地徑約3.0 mm，苗高約36.5 cm)移栽于黃心土∶珍珠巖∶腐熟雞糞∶草炭(體積比為2∶2∶2∶4)的混合土壤中，選擇底部有孔的塑料盆(內(nèi)徑8.5 cm，深 10.0 cm)，每盆 1 株?；|(zhì)的有機質(zhì)為 73.3 g·kg?1，全氮為 72.35 g·kg?1，全磷為 2.19 g·kg?1，全鉀為9.55 g·kg?1，pH為6.44。所有幼苗每日澆水，保持土壤濕潤，晝夜溫度自然過渡。4周后，待植株長出第4對復葉時(2016年7月初)，利用不同顏色LED燈處理：挑選800盆生長健壯且外形較一致的青錢柳幼苗進行光質(zhì)處理。光質(zhì)和家系交互試驗按照隨機區(qū)組試驗，共16個處理(表1)，每個處理5個重復，每個重復10株。實驗處理如下：W為對照白光(波段400～690 nm，峰值445 nm/560 nm)，R為紅光處理(波段600～690 nm，峰值653 nm)，G為綠光處理(波段460～597 nm，峰值514 nm)，B為藍光處理(波段400～500 nm，峰值456 nm)。LED光譜特性由NIR-VIS光譜儀(海洋光學，美國)進行測定，各處理下光量子通量控制在 (800±50) μmol·m?2·s?1。

表 1 二裂式裂區(qū)試驗設計Table 1 Split-plot randomized design of the experiment

1.2 研究方法

1.2.1 生物量測定 處理第80天(觀測到顯著的生長和形態(tài)差異時)測定青錢柳苗高和地徑，并從各處理中拔取3株接近其平均值的完整植株測定生物量。先將根沖洗干凈，然后用剪刀將根部與地上部分分開，并放在標記好的牛皮紙袋中帶回實驗室，于105 ℃烘箱中殺青0.5 h，然后80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒量，稱取根部與地上部分干質(zhì)量。單株總生物量是地上和地下部分生物量干質(zhì)量之和。

1.2.2 三萜類化合物測定 將生物量測定完成后的樣品研磨成粉末，并密封保存在0～4 ℃冷庫。每個處理稱取約2 g干樣葉片粉末，用濾紙包好后放入250 mL索氏提取器，并用石油醚在70 ℃水浴鍋中回流提取4 h，以去除葉樣品中極性較小的脂溶性成分。丟棄提取液將藥渣在室溫下自然晾干，晾干后的藥渣作為三萜類提取的樣品。本研究采用超聲波輔助提取法[15]：用體積分數(shù)70%乙醇水溶液在70 ℃水浴下超聲提取45 min，在同樣條件下提取2次，并將2次提取液合并。合并后的提取液揮發(fā)至近干，再以甲醇反復清洗殘渣并定容至10 mL作為三萜類質(zhì)量分數(shù)測定的樣品。

三萜類化合物單體質(zhì)量分數(shù)用HPLC法進行測定。分析前，所有待測樣品原液用0.22 μm有機膜過濾純化，測定參照CAO等[16]的方法。本研究共檢測到6個三萜類次生代謝產(chǎn)物單體(阿江欖仁酸、青錢柳酸B、青錢柳苷B、青錢柳苷A、常春藤皂苷元、齊墩果酸)，根據(jù)峰面積計算各單體含量。色譜條件：Waters 2695 Alliance高效液相系統(tǒng)、Empower 3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、UVD 2996 二極管陣列檢測器(DAD)、Waters X-Bridge C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)。流動相為含有0.01%(V/V)甲酸的水溶液(溶液A)和含0.01%(V/V)甲酸的乙腈溶液(溶液B)。梯度洗脫：A溶液與B溶液(V/V)比值：0～13 min為 92∶8，13～28 min 為 81∶19，28～42 min 為 79∶21，42～60 min 為 50∶50，60～64 min 為 55∶45，64～74 min為 44∶56，74～90 min 為 34∶66，90～95 min 為 15∶85，95～100 min 為 0∶100。流動相流速為 1.0 mL·min?1，柱溫為45 ℃，進樣量為10.0 μL，檢測波長為205 nm?？?cè)瀑|(zhì)量為所檢測到的所有三萜單體質(zhì)量的總和?？?cè)?(單體)單株產(chǎn)量 (mg·株?1)=總?cè)?(單體)質(zhì)量分數(shù) (mg·g?1)×葉生物量 (g·株?1)

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0分析處理數(shù)據(jù)。光質(zhì)和家系對青錢柳生物量及葉三萜類化合物積累的影響及其交互作用采用兩因素方差分析，多重比較采用Duncan’s算法。數(shù)據(jù)為平均值±標準差，用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 光質(zhì)對不同家系青錢柳生物量積累的影響

不同處理下青錢柳根、莖、葉及總生物量干質(zhì)量積累的變異范圍分別為4.1～7.3、4.3～7.2、4.5～7.7、13.0～21.4 g·株?1(表2)。在白光下生長的青錢柳植株總干質(zhì)量和莖、葉片干質(zhì)量最大。方差分析結果表明：光質(zhì)、家系及兩者的交互作用均對青錢柳各部分生物量的積累產(chǎn)生了顯著影響(P＜0.05)。與白光相比，其他光質(zhì)處理下的青錢柳總生物量都顯著下降(P＜0.05)；而根、莖及葉生物量的積累在處理間也具有與總生物量相似的變異規(guī)律。不同家系青錢柳總生物量的均值在紅光、綠光和藍光下分別降低17.84%、31.46%、4.69%。然而，安吉家系的青錢柳總生物量在藍光與白光處理間沒有顯著差異。

2.2 光質(zhì)對不同家系青錢柳葉三萜質(zhì)量分數(shù)的影響

總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)在處理間的變異范圍為1.2～9.4 mg·g?1，主要的青錢柳三萜單體為齊墩果酸，變異范圍為0.4～3.8 mg·g?1(表3)。光質(zhì)和家系及其交互作用對青錢柳葉三萜單體及其總質(zhì)量分數(shù)的影響都十分顯著(表4)?？傮w來講，與對照白光相比，單一波段的紅光、綠光、藍光下的青錢柳苷B、青錢柳苷A、常春藤皂苷元、齊墩果酸及總?cè)凭兴陆?表3)，最高質(zhì)量分數(shù)出現(xiàn)在WA、WA、WJ6、WM、WJ7處理；而阿江欖仁酸和青錢柳酸B的最高質(zhì)量分數(shù)分別出現(xiàn)在RJ7和RA處理。不同家系之間的青錢柳葉三萜類化合物的質(zhì)量分數(shù)差異顯著(P＜0.05)。總體來看，金鐘山7號家系的青錢柳葉總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)最高(表5)。

表 2 不同家系青錢柳生物量積累對光質(zhì)的響應Table 2 Response of biomass accumulation of C.paliurus from different families to light quality

表 3 光質(zhì)和家系對青錢柳葉三萜物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的影響Table 3 Effects of light quality and family on triterpenoid contents in C.paliurus leaves

2.3 光質(zhì)對不同家系青錢柳葉三萜單株產(chǎn)量的影響

在葉片生物量與三萜質(zhì)量分數(shù)的基礎上得出了單株三萜類化合物組分的產(chǎn)量，總?cè)茊沃戤a(chǎn)量的變異范圍為 5.6～60.7 mg·株?1(圖 1)。本研究表明：光質(zhì)和家系及其交互作用顯著影響(P＜0.05)了總?cè)萍捌鋯误w的單株產(chǎn)量；三萜單株產(chǎn)量的最高值都在白光處理下獲得(圖1，表6～8)。從家系層面講，總?cè)茊沃戤a(chǎn)量最高值從金鐘山7號家系獲得，安吉1號家系次之(表8，圖1)。

表 4 光質(zhì)、家系及兩者的交互作用對青錢柳葉三萜物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的影響Table 4 Summary of significance levels for the effects of light quality, family and their interaction on triterpenoid contents of C.paliurus leaves

表 5 不同處理對青錢柳葉三萜物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的Duncan’s多重比較的影響Table 5 Effects of different treatments on Duncan’s multiple-range test for triterpenoid contents of C.paliurus leaves

圖 1 不同家系青錢柳葉總?cè)茊沃戤a(chǎn)量對光質(zhì)的響應Figure 1 Response of total triterpenoid yields in C.paliurus leaves from different families to light quality

3 討論

環(huán)境和遺傳因子對植物的生長和次生代謝產(chǎn)物如三萜類化合物的積累都有影響[17]。植物體內(nèi)的光敏色素會感知外界的光質(zhì)變化，從而影響植物的光合作用、生長發(fā)育和形態(tài)建成、生理代謝以及結構特征等[18]。本研究表明：白光和藍光處理下的青錢柳幼苗生長較好，其根、莖、葉生物量和總生物量均高于綠光和紅光處理的青錢柳幼苗?？紤]到本研究所用的白光LED含有藍光波段(445 nm)，可推測藍光對青錢柳苗期生長的作用可能大于其他波段的光。這一結果和肉蓯蓉Cistanche deserticola、金線蓮Anoectochilusroxburghii等植物的光質(zhì)研究結果較為一致[18?19]。MATLOCK等[20]研究表明：不同地區(qū)生長的松香藻Portieriahornemannii主要活性成分鹵代單萜烯類(Apakaochtodenes A和B)的含量存在明顯差異。李彥等[21]研究表明：光照強度和遺傳因子對青錢柳葉的三萜類化合物積累影響十分顯著。而梅錫玲等[22]研究發(fā)現(xiàn)：不同的LED藍光、綠光處理有利于靈芝GanodermaLucidum菌絲體內(nèi)總?cè)频姆e累。范桂枝等[23]研究發(fā)現(xiàn)：不同光質(zhì)對白樺Betulaplatyphylla愈傷組織三萜的積累從大到小依次為藍光、紅光、黃光、綠光，說明藍光有利于三萜類物質(zhì)的積累。但本研究結果顯示：青錢柳總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)在浙江安吉和四川沐川家系的白光處理下最多，藍光次之，這說明不同植物體內(nèi)活性組分的積累對環(huán)境的響應存在著顯著的種屬差異。從光質(zhì)處理的角度分析，三萜類化合物的積累在生長好的白光處理下最高，而在生長差的藍光和綠光處理下較低；DENG等[7]和李彥等[21]研究也表明：當光照強度降低時，青錢柳的生長會受到抑制，而黃酮類化合物和三萜化合物的積累也明顯降低。這一結果和氮素/營養(yǎng)平衡假說[24]較為一致，即當植物生長受到環(huán)境(水、光等)脅迫時，以碳為基礎的初生生長及次生代謝產(chǎn)物的積累會受到限制。

表 6 光質(zhì)和家系對青錢柳葉三萜單體產(chǎn)量的影響Table 6 Effects of light quality and family on yields of individual triterpenoids in C.paliurus leaves

表 7 光質(zhì)、家系及兩者的交互作用對青錢柳葉三萜單體單株產(chǎn)量的影響Table 7 Summary of significance levels for the effects of light quality, family and their interaction on individual triterpenoid yields of C.paliurus leaves

柯仲成等[25]發(fā)現(xiàn)：枇杷Eriobotryajaponica葉中的三萜酸是主要有效活性成分之一，其中熊果酸、科羅索酸和山楂酸具有顯著的降血糖、抗炎和抗腫瘤等藥理作用。彭艷芳等[26]也發(fā)現(xiàn)：山杏Armeniaca sibirica葉中所含有的齊墩果酸、熊果酸和樺木酸也對腫瘤具有非常明顯的抑制作用。了解三萜單體酸的藥理作用和功能，對于更好、更有針對性地培育獲取三萜單體化合物具有重要意義。已有研究表明：青錢柳的降糖降脂及抗氧化功效和其內(nèi)含的三萜類物質(zhì)密切相關，尤其是其特有的單體組分如青錢柳酸B、青錢柳苷A和青錢柳苷B等[4]。李新宇等[27]通過對1年生白樺幼樹葉片進行不同光質(zhì)處理發(fā)現(xiàn)：綠光可提高齊墩果酸的含量，藍光可提高白樺酯醇的含量，分別為對照白光的13.280和1.959倍，這與本研究的結果較為一致，藍光和綠光也有利于青錢柳葉片內(nèi)部分三萜單體(如齊墩果酸)的積累。對于青錢柳特有的三萜組分(青錢柳酸B、青錢柳苷A和青錢柳苷B)來說，紅光處理可能效果更好，但考慮到青錢柳葉三萜產(chǎn)量時，四川沐川家系的白光處理效果較好。