去泛素化酶BRCC3的研究進展

張聰慧，徐紹業(yè)，秦坤，韓雨，邵曉云,3*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，廣西 桂林 541100；2.桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，廣西 桂林 541100； 3.廣西腦與認知神經(jīng)科學(xué)重點實驗室，廣西 桂林 541100)

0 引言

蛋白質(zhì)翻譯后修飾參與人體細胞的生命活動，包括甲基化、磷酸化、泛素化修飾等，其中泛素化修飾在蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)中扮演了重要的修飾方式角色。去泛素化酶通過分開泛素分子和蛋白底物，單個泛素分子重新進入細胞循環(huán)中，重新進行去泛素化調(diào)節(jié)。BRCC3屬于JAMM金屬結(jié)構(gòu)域家族，是一種損傷應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，在多種組織器官中表達，參與DNA損傷修復(fù)、免疫調(diào)控等多條通路，影響膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、骨質(zhì)疏松等多種疾病的病理生理過程。本文綜述了近年來關(guān)于去泛素化酶BRCC3在作用機制和疾病進程方面的研究進展。

1 基本概念

1.1 泛素

泛素(Ubiquitin，Ub)含有76個氨基酸，存在于結(jié)構(gòu)保守的蛋白家族中，調(diào)節(jié)真核生物體內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)的一系列過程。通過其C端以單體形式與目標(biāo)蛋白上的賴氨酸殘基結(jié)合[1]。泛素通過與其他蛋白的共價結(jié)合來實現(xiàn)其功能，從而改變靶蛋白的穩(wěn)定性和活性。泛素可以識別跨膜蛋白，參與膜泡運輸。泛素分子與靶蛋白相結(jié)合發(fā)揮功能通過多個方面參與細胞生命活動：細胞分裂、細胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡[2]。

1.2 泛素化與去泛素化(Deubiquitin)

泛素化是指蛋白質(zhì)中的泛素分子標(biāo)記靶蛋白并修飾其活性的過程。泛素化是人類細胞生命活動中蛋白質(zhì)翻譯修飾的一個重要調(diào)節(jié)方式，是蛋白質(zhì)活性和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。泛素由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶調(diào)節(jié)[1]。泛素化已經(jīng)成為許多生理過程的重要調(diào)節(jié)方式，包括蛋白質(zhì)定位、炎癥免疫、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體內(nèi)吞和運輸?shù)?。去泛素化是泛素的逆向過程，是指特異性的水解酶去除與靶蛋白和泛素結(jié)合的泛素分子。

1.3 泛素化酶和去泛素化酶

蛋白質(zhì)的泛素化是由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)作用的，該系統(tǒng)被廣泛認為是一種通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)各種蛋白質(zhì)表達功能水平的重要機制。由泛素、E1、E2和E3、26S蛋白酶體(Proteasome)和泛素解離酶共同組成，E3是通過識別同源底物中的特定序列和結(jié)構(gòu)元件，通過與底物共價修飾來調(diào)節(jié)。E1通過ATP供能激活泛素分子，E2結(jié)合激活的泛素分子，E3識別E2上的靶蛋白并對其進行泛素化修飾，在泛素的C端和底物的Lys殘基之間形成異肽鍵[3]。泛素化可以產(chǎn)生得到泛素聚合物中大量的結(jié)構(gòu)信息，生成泛素鏈[4]。多聚泛素化蛋白可被去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes，DUBs)去除。去泛素化酶去除泛素與底物蛋白的連接，將單個的泛素分子從泛素化蛋白底物上剝離，進入細胞內(nèi)重新調(diào)節(jié)[5-7]。26S蛋白酶體是一種可以同時識別Lys48和Lys63位連接的泛素化蛋白，Lys48連接的蛋白質(zhì)泛素化較為常見。通常K48結(jié)合的蛋白會被轉(zhuǎn)移到26s蛋白酶體直接結(jié)合降解；而Lys63連接的多聚泛素化則與蛋白質(zhì)降解無關(guān)，K63位點參與調(diào)控細胞內(nèi)NF-kB、內(nèi)吞自噬等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、核糖體功能等[8,9]。

2 去泛素化酶分類以及BRCC3蛋白

人類基因組編碼近100個去泛素化酶，可劃分為以下五個不同的家族：卵巢腫瘤蛋白酶(Ovarian tumor protease，OUT)，這一類蛋白酶與其他類型去泛素化酶氨基酸序列不 一 樣，與USP家 族 相 似；Josephin域(Josephin domain，MJD)發(fā)現(xiàn)Ataxin-3可以水解泛素溶解酶；泛素C末端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase，UCHs)屬于半胱氨酸蛋白酶；泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease，USP)包括組氨酸盒和賴氨酸盒兩個片段；JAMM/MPN金屬酶(Josephin and JAB1/MPN/MOV34 metalllo enzyme，JAMM)結(jié)構(gòu)域家族，具有MPN序列，能結(jié)合泛素化蛋白上的泛素分子。

JAMM家族由許多鋅依賴性金屬蛋白酶組成，二價鋅離子與2個組氨酸和1個天冬氨酸共價結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)第六種去泛素化酶——單核細胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein)屬于半胱氨酸蛋白酶[10]。目前已知JAMM家族的去泛素化酶至少包含POH1，CSN5，BRCC36，AMSH，AMSH-LP五種。

人BRCC36(BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36，小鼠BRCC3的同源物)屬于去泛素化酶JAMM家族成員之一[1,12,13]，它廣泛表達于心臟、腦、肌肉、腎臟以及小腸等器官。BRCC36是BRCA1-A和BRISC兩種多蛋白復(fù)合物的催化亞基，前者通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)途徑的選擇來保護基因組的完整性，后者服務(wù)于細胞應(yīng)激反應(yīng)和免疫信號功能。小鼠BRCC3 (BRCA1-BRCA2-containing complex 3)作為BRCC的亞基之一，有10個轉(zhuǎn)錄物(剪接變異)，3個副核苷類，204個正交物[2,5,11]。BRCC3開放閱讀框架由529個氨基酸組成，該蛋白序列保守性較高。作為一種新的細胞周期調(diào)控分子，具有去除Lys-63位泛素鏈的特異性活性。

3 去泛素化酶BRCC3及其作用機制

BRCC3基因是一種損傷應(yīng)答調(diào)節(jié)基因，廣泛分布于心臟、腦、肌肉、腎臟和小腸等，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期進程調(diào)控[13]及DNA損傷修復(fù)[14,15]過程，修飾方式和某些心血管疾病[16]、腫瘤的發(fā)生[17]及炎癥小體激活密切相關(guān)[18]。然而BRCC3蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機制尚不清楚，研究證明BRCC3主要是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的。ABRO1是BRCC36異肽酶復(fù)合體(BRISC)的一個亞基，它與E3泛素連接酶WWP2競爭性結(jié)合BRCC3，使得WWP2無法介導(dǎo)BRCC3泛素化，從而保持蛋白穩(wěn)定[19-22]。

人BRCC36(鼠同源物BRCC3)是由BRCC3基因編碼的一種多肽，廣泛表達于人體的大腦、脾、腎臟等多種器官組織。該蛋白是一種鋅依賴性去泛素化酶(DUBs)，可識別賴氨酸K63位殘基相互連接形成的泛素鏈從而進行去泛素化修飾。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[4,5,23]，JAMM家族介導(dǎo)的BRCC36在NF-KB細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、先天免疫、細胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[11]，細胞內(nèi)BRCC36主要參與形成BRCC(BRCA1/BRCA2-containing complex)和BRISC(BRCC36 containing isopeptidase complex)兩種蛋白復(fù)合物，與MPN序列結(jié)合介導(dǎo)去泛素化功能，由損傷反應(yīng)BRCA1-Rap80復(fù)合物和Cy-卵胞漿BRCC36異肽酶復(fù)合物(BRISC)兩種不同的蛋白復(fù)合物組成。Feng等[5]在該文中發(fā)現(xiàn)除了BRCA1-A復(fù)合物(包括RAP80、CCDC98/Abraxas、BRCC45/BRE和MERIT40/NBA1外，發(fā)現(xiàn)BRCC36與另一相關(guān)蛋白KIAA0157結(jié)合。該蛋白與CCDC98在N末端序列同源性達39%，KIAA0157主要定位于胞漿，激活胞漿中的BRCC36，表明支架蛋白參與BRCC36活性的調(diào)節(jié)。目前JAMM類金屬蛋白酶包括POH1(人PAD1同源物，酵母中稱為Rpn11)、CSN5(COP9信號體亞單位)、BRCC36、AMSH/AMSH-LP[24,25]，JAMM需要與多亞基復(fù)合物相互結(jié)合作用才能激發(fā)活性，POH1通過形成26S蛋白酶體可進行泛素化修飾、CSN5擁有去泛素化活性需要通過形成COP9信號體，AMSH和AMSH-LP自帶去泛素化活性[2]。BRCC36蛋白需要與其他亞基結(jié)合才能形成泛素化鏈發(fā)揮對蛋白的去泛素化作用，因為沒有與泛素鏈直接結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[5,26]。

4 去泛素化酶BRCC3的功能

4.1 參與DNA損傷修復(fù)

BRCA1促進DNA雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)是通過同源重組來進行的，保護DNA復(fù)制叉[27-30]。在這項研究中表明BRCC36是一種Lys-63鏈特異的DUB，H2A組蛋白是BRCC36的底物之一，BRCC36和DUSP3與DNA損傷反應(yīng)有關(guān)，而USP3屬于USP家族，USP3的缺失可使H2A和H2B發(fā)生泛素化從而保護DNA免受損傷[5,28,29]。BRCC36的去泛素化活性可在DNA雙鏈斷裂中具有泛素識別和修復(fù)作用，可微調(diào)DNA修復(fù)。BRCC36是使BRCA1-A復(fù)合物有去泛素化活性的亞基，降低BRCC36的去泛素化活性可以減少BRCA1-A在DSB上的積聚，減少積聚有利于DSB末端切除不受BRCA1-A的抑制，DNA修復(fù)即可進行[30]。

4.2 參與信號通路泛素化調(diào)節(jié)參與炎癥

泛素由賴氨酸殘基與單體泛素相互作用連接形成泛素鏈，前期通過研究K48和K63賴氨酸發(fā)現(xiàn)K48連接蛋白底物能被蛋白酶體識別降解，K63則是參與蛋白活化和信號傳導(dǎo)。Singh等[31]實驗發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中siRNA轉(zhuǎn)染敲低BRCC36，結(jié)果顯示NLRP3炎癥小體、Caspase-1和IL-1β分泌水平顯著降低，表明BRCC36可以調(diào)節(jié)炎癥小體活性，同時也發(fā)現(xiàn)在OX-LDL誘導(dǎo)刺激下炎癥小體活性激活是通過BRCC36得以實現(xiàn)的，證明了BRCC36可能是參與OX-LDL激活炎癥小體的重要分子。抑制BRCC36去泛素化活性可抑制NLRP3炎癥體的激活，這可能是抑制炎癥發(fā)生的潛在靶點。研究表明BRCC3能夠調(diào)節(jié)NLRP3活性，用G5去泛素化小分子抑制劑可抑制NLRP3的炎性活性，通過去泛素化來調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體，提供了炎癥性疾病潛在的NLRP3泛素化治療靶點[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)BRCC3在帕金森病模型中的表達增加，用shRNA慢病毒敲除BRCC3可使NLRP3神經(jīng)元炎癥體減少，抑制BRCC3可減少IL-1β的分泌，進一步證明NLRP3炎癥的激活的通過去泛素化機制調(diào)節(jié)的，確定了BRCC3是NLRP3泛素化活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[35]。該研究首次證實BRCC36在HT1080細胞水平具有抗病毒效應(yīng)且不依賴于去泛素化活性，U3A細胞中缺少STAT1則不具有抗病毒效應(yīng)，推測BRCC36抗病毒作用可能是依賴STAT1，并發(fā)現(xiàn)BRCC36能與STAT1相互作用，通過USP13上調(diào)STAT1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)BRCC36能夠通過去泛素化酶調(diào)節(jié)STAT1的泛素化[36]。

4.3 參與先天免疫(眼表炎癥)干眼模型中，發(fā)現(xiàn)眼表上皮細胞一種新的天然免疫途徑

應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激，氧化線粒體DNA能夠通過刺激Caspase-8和BRCC36進而激活NLRP3/NLRP6炎性小體。激活的NLRP3和抑制的NLRP6刺激caspase-1的激活，刺激白介素-1β和白介素-18的成熟和分泌[37]。在BRISC中，BRCC3參與去泛素化，從而調(diào)節(jié)不同的靶蛋白，包括NLRP3和1型干擾素(IFN)受體鏈1(IFNAR1)。BRCC3表達水平降低與NLRP3和白細胞介素(IL-1β)降低有關(guān)[13,19]。

5 去泛素化酶BRCC3對疾病的影響

5.1 膠質(zhì)細胞瘤

Humphreys等[38]發(fā)現(xiàn)PARK2是一種E3泛素連接酶，在膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma，GB)中常發(fā)生突變和缺失，PARK2連接酶可以直接通過泛素化調(diào)節(jié)EGFP在蛋白水平上的表達，通過間接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)mRNA水平的表達[39]。

BRCC3除了在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用外，還參與細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控等其他細胞途徑。BRCC3作為BRISC復(fù)合體的一部分，使其底物IFNAR1去泛素化，從而影響干擾素信號。發(fā)現(xiàn)BRCC3突變減弱了IFNAR1的DUB活性，導(dǎo)致AML細胞中干擾素反應(yīng)減弱。證明BRCC3突變通過削弱IFNAR1的去泛素化和功能使AML細胞對干擾素α介導(dǎo)的毒性不敏感。在急性髓細胞白血病細胞中，BRCC3失活導(dǎo)致炎癥小體活性減弱，IL-1β釋放減少，BRCC3突變可使其底物發(fā)生泛素化改變和細胞因子釋放增加[40]。

5.2 宮頸癌

本研究結(jié)果表明，在宮頸癌組織、HeLa、Siha和C33A宮頸癌細胞中BRCC3表達水平均有所升高。BRCC3通過上調(diào)E-cadherin表達水平和下調(diào)Vimentin、MMP-2、MMP-9、SNAI1和SNAI2表達水平。研究結(jié)果提示BRCC3是一個與宮頸癌相關(guān)的癌基因，也可能成為宮頸癌患者診斷、治療和預(yù)后的一種新的治療生物標(biāo)志物[41]。BRCA1基因編碼1863個氨基酸蛋白，BRCA1是早發(fā)性乳腺癌的一個易感基因[31,32]，BRCC3在多種乳腺腫瘤中過表達。發(fā)現(xiàn)BRCA1參與卵巢癌凋亡、自噬和耐藥性[33,34]。

5.3 骨質(zhì)疏松

Cai等實驗結(jié)果得到三個可能與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因：BRCC3、UBE2N和UBE2K。骨質(zhì)疏松癥患者分離的成骨細胞UBE2N和UBE2K mRNA與正常對照組相比無明顯變化，而BRCC3 mRNA顯著升高。此外，BACC3過表達后發(fā)現(xiàn)成骨分化受到抑制，且β-catenin表達降低。表明BRCC3可參與骨質(zhì)疏松發(fā)生分化[42]。

5.4 煙霧病綜合征

煙霧病是由于去除MTCP1/MTCP1NB和BRCC3導(dǎo)致Xq28減少。還發(fā)現(xiàn)在斑馬魚中BRCC3敲除后，血管生成缺陷，這些缺陷可以通過內(nèi)皮特異性的BRCC3表達來彌補。這些結(jié)果均表明BRCC3，作為一種去泛素酶，細胞BRCA1和BRISC復(fù)合體的一部分，在血管生成中起著重要的作用[43]。

5.5 心臟病泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (UPS)

通過靶向降解信號和結(jié)構(gòu)蛋白來影響心肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能，在早期心臟重塑和病理性肥大中，蛋白酶體抑制可以限制疾病進展，通過改變基因、藥物等來增強蛋白酶體活性可改善心肌病和心肌梗死患者由于心臟和UPS功能受損預(yù)后，蛋白酶體抑制劑首次應(yīng)用于檢測UPS在心臟病表型中的作用，可作為新的治療藥物[44]。ABRO1在心肌細胞中高表達，心肌梗死時表達增加，有助于心臟保護作用[45]。

5.6 鼻咽癌

研究結(jié)果顯示鼻咽癌患者中BRCC3表達增高，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。敲除BRCC3基因可降低鼻咽癌細胞的放射抗性，敲除BRCC3基因后，鼻咽癌細胞增多，DAN修復(fù)能力減弱，細胞周期停滯與G2/M期，這些發(fā)現(xiàn)提示BRCC3可作為鼻咽癌的預(yù)后生物標(biāo)志物和新治療靶點[8]。

5.7 骨髓增生

異常髓系腫瘤檢測中發(fā)現(xiàn)BRCC3基因體細胞突變，各種髓系腫瘤中共發(fā)現(xiàn)了28個突變，MDS和MDS/MPN中BRCC3突變更為常見，且BRCC3突變與-γ異常有關(guān)，在MDS和MDS/MPN中發(fā)現(xiàn)了BRCC3新的體細胞突變和其他BRCA1-A復(fù)雜成分的缺失。小鼠LSK細胞中BRCC3基因敲除后腫瘤細胞增加近一倍，轉(zhuǎn)染BRCC3shRNA后造血干細胞分化能力減弱，BRCC3的突變可促進白血病可能與這些病變對腫瘤的影響有關(guān)。這些研究結(jié)果都充分提示BRCC3能夠在治療骨髓增生異常可以發(fā)揮作用[18]。

6 結(jié)語

去泛素化酶家族擁有多個家族成員，BRCC3在DNA損傷修復(fù)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、煙霧病、宮頸癌、心臟病等疾病中發(fā)揮去泛素化作用，進而影響細胞病理生理進程，通過綜述去泛素化酶BRCC3的作用機制及在疾病中的作用，從而有利于將BRCC3作為重要的泛素化靶點基因開發(fā)對應(yīng)的藥物，提供新的治療視角。