5hmC在癌癥早期診斷中的應(yīng)用

申嘉澍，李麟宛，董天雨

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100000；2.北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，北京 100000； 3.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100000)

0 引言

隨著遺傳學(xué)研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了越來越多的腫瘤標(biāo)志物，并嘗試通過表觀遺傳學(xué)來研究癌癥早期診斷[1,2]。5-羥基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是哺乳動(dòng)物DNA胞嘧啶堿基修飾，大部分位于DNA的轉(zhuǎn)座子上，轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列可損害基因組的功能和穩(wěn)定性，當(dāng)轉(zhuǎn)座子的5hmC修飾減少時(shí)，轉(zhuǎn)座子活性在細(xì)胞中被激活，易進(jìn)而損傷DNA，誘發(fā)癌癥[3,4]。近年來，隨著高精確的質(zhì)譜分析技術(shù)不斷發(fā)展，對(duì)5hmC的檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步，5hmC作為DNA修飾越來越受到重視。本文系統(tǒng)回顧了癌癥早期診斷時(shí)5hmC作為腫瘤標(biāo)志物的理論依據(jù)，總結(jié)了現(xiàn)有5hmC檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)及其局限性，并討論了5hmC未來在癌癥早期診斷方面的發(fā)展趨勢(shì)。

1 新興腫瘤標(biāo)志物——5hmC

1.1 5hmC的生物學(xué)合成

早在1972年，5hmC就已經(jīng)在成年大鼠、小鼠以及青蛙腦組織中發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時(shí)并沒有引起足夠的重視，被認(rèn)為是樣品中氧化反應(yīng)引起的DNA異常，因而未引起重視。直到2009年，先后兩個(gè)研究發(fā)現(xiàn)5hmC在小鼠浦肯野細(xì)胞及小腦顆粒細(xì)胞中存在，從而引起學(xué)者的廣泛關(guān)注DNA羥甲基化，即胞嘧啶向5hmC的轉(zhuǎn)化。由5-胞嘧啶合成5-羥甲基胞嘧啶的關(guān)鍵分子是TET家族蛋白。哺乳動(dòng)物DNA胞嘧啶復(fù)制后通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMT) 的作用，利用腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作為甲基供體，在胞嘧啶堿基5位上添加甲基，從而形成5甲基胞嘧啶。而活性DNA脫甲基化途徑可通過TET酶(TET1、2和3)的活性來介導(dǎo)。TET酶是依賴Fe(II)和α-酮戊二酸(α-KG)的雙加氧酶家族[5]。研究證明，TET酶能在培養(yǎng)細(xì)胞和體外通過鐵和α-酮戊二酸依賴性方式的氧化催化5甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)換成5-羥甲基胞嘧啶[6,7]。此外，其他通路也與TET酶一起參與了羥基化至5hmC的過程。

1.2 5hmC在人體各細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中分布

早在1970年代，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了人體中的5hmC，此后在各種組織和細(xì)胞類型中都發(fā)現(xiàn)了5hmC[8,9]。人體不同組織之間的5hmC含量有顯著差異，這表明5hmC可以用作細(xì)胞或組織類型的標(biāo)識(shí)符[10]。最近應(yīng)用新研制的5hmC免疫學(xué)技術(shù)，確定了5hmC在人體組織中豐度，發(fā)現(xiàn)不同組織之間的5hmC含量有顯著差異。腦組織中5hmC的含量最高(0.67%)，而直腸(0.57%)、肝臟(0.46%)、結(jié)腸(0.45%)和腎臟(0.38%)的含量次之。肺中的5hmC含量相對(duì)較低(0.14%)，胎盤中的5hmC含量更低(0.06%)，乳腺中的含量?jī)H為0.05%[11]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中5hmC修飾大量降低，除腦腫瘤外，與腫瘤周圍的正常組織相比，在包括癌性結(jié)直腸組織、肝、腎、肺、骨骼肌、前列腺癌、乳腺癌和黑素瘤等實(shí)體瘤中，5hmC水平都降低了很多，甚至在結(jié)腸癌細(xì)胞中降低到無法檢測(cè)的水平。其他研究人員通過顯示不同類型實(shí)體瘤中5hmC的損失證實(shí)了這一觀察結(jié)果[12,13]。5hmC分布的這種組織特異性，暗示了其潛在的用來診斷不同器官腫瘤的可能。

1.3 5hmc作為癌癥早期診斷的生物標(biāo)志物

來自患者血液的表觀修飾5hmC可以作為人類疾病的早期診斷很有價(jià)值的生物標(biāo)志物，因?yàn)槠涓爬讼嚓P(guān)細(xì)胞的基因表達(dá)變化。近年來，5hmC逐漸成為了癌癥早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。研究表明，循環(huán)DNA中的5hmC標(biāo)記可作為不同類型人類腫瘤的表觀遺傳標(biāo)記[14-16]。針對(duì)前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究顯示，5hmC標(biāo)記水平的降低與不良預(yù)后結(jié)局相關(guān)[17,18]。低水平的5hmC也是總體生存率和癌癥復(fù)發(fā)時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[19]。而臨床試驗(yàn)顯示，5hmC在非小細(xì)胞肺癌中聯(lián)合表觀遺傳學(xué)診斷的效果優(yōu)異[20]。這些實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是支持5hmC作為癌癥篩查生物標(biāo)志物的理論依據(jù)。

2 癌癥生物標(biāo)志物的特異性檢測(cè)

2.1 傳統(tǒng)組織活檢與液體活檢

腫瘤組織是鑒定癌癥特異性生物標(biāo)志物的金標(biāo)準(zhǔn)來源，也是現(xiàn)有癌癥檢測(cè)與診斷的最主要手段[21]。然而，由于組織活檢具有侵入性和臨床風(fēng)險(xiǎn)，所以組織活檢具有一些局限。組織活檢通常需要手術(shù)切除獲得腫瘤組織，手術(shù)會(huì)帶來出血和感染等風(fēng)險(xiǎn)[22]。除此之外，從單一區(qū)域組織活檢獲得的腫瘤信息具有空間局限性，且可能無法反映腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[23]。相比之下，液體活檢作為一種微創(chuàng)工具，在癌癥治療方面具有更大的優(yōu)勢(shì)。它采用循環(huán)物質(zhì)如循環(huán)DNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)和外泌體來檢測(cè)指示癌癥進(jìn)展的分子變化，在臨床上的應(yīng)用潛力極大。

2.2 循環(huán)DNA在癌癥診斷中的作用

循環(huán)DNA(circulating free DNA，cfDNA)是癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移、死亡時(shí)，釋放到患者血液中的DNA。通過檢測(cè)循環(huán)DNA與癌癥相關(guān)的遺傳改變，如點(diǎn)突變，拷貝數(shù)變異，染色體重排和表觀遺傳畸變[24,25]，可以進(jìn)行癌癥的早期診斷。cfDNA的發(fā)現(xiàn)為臨床帶來了革命性的潛力[26]，cfDNA中的非侵入性生物標(biāo)志物比組織活檢具有實(shí)質(zhì)性優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兛捎^測(cè)到腫瘤組織的完整遺傳標(biāo)記與表觀遺傳改變，特別是有助于檢測(cè)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的異常DNA甲基化過程[27,28]。而且，與現(xiàn)有的診斷和預(yù)后方法相比，cfDNA分析屬于微創(chuàng)，沒有腫瘤活檢和潛在并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，從而為困難或不安全的腫瘤活檢提供了一種分子譜分析替代方法。

2.3 5hmC的檢測(cè)

影響人類疾病中5hmC途徑的機(jī)制作用仍待探究中，但是它們作為診斷標(biāo)志物或治療靶標(biāo)的潛力已經(jīng)得到了領(lǐng)域認(rèn)可與理論支持。5hmC的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為DNA甲基化檢測(cè)方法。基于亞硫酸氫鹽的全基因組測(cè)序和簡(jiǎn)并代表性硫酸氫鹽測(cè)序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)是甲基化分析的傳統(tǒng)方法，并已應(yīng)用于cfDNA的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)[29]。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法并未將5mC與5hmC區(qū)別開?，F(xiàn)階段，高分辨率下繪制5hmC基因組分布圖的創(chuàng)新技術(shù)不斷發(fā)展，可用于5hmC的高效檢測(cè)，例如單分子實(shí)時(shí)測(cè)序[30]，TET輔助亞硫酸氫鹽測(cè)序[31]，氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序[32]和AbaSI偶聯(lián)測(cè)序[33]?，F(xiàn)有研究已經(jīng)在單核苷酸分辨率下確定了5hmC在胚胎干細(xì)胞和大腦中的基因組分布[34]。作為一種重要的表觀遺傳標(biāo)記，5hmC的超靈敏液體檢測(cè)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極其重要的意義。但是，由于5hmC的含量較低，新發(fā)展的方法必須能夠克服處理過程中樣品損壞和損失的難題，此外，為了提高檢測(cè)靈敏度，新發(fā)展的方法必須能夠選擇性富集和擴(kuò)增5hmC DNA。從富集所得計(jì)數(shù)推斷堿基分辨率級(jí)別5hmC修飾水平的統(tǒng)計(jì)方法可有助于增加對(duì)5hmC動(dòng)態(tài)的了解。

3 5hmC在癌癥診斷中的臨床意義

3.1 5hmC與癌癥表觀遺傳

隨著生物學(xué)研究的深入，將5hmC與葡萄糖代謝和癌癥表觀遺傳學(xué)聯(lián)系起來，已有報(bào)道顯示，cfDNA的全基因組5hmC動(dòng)態(tài)變化對(duì)改善癌癥管理具有臨床意義。目前對(duì)5hmC生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的研究主要集中在基因區(qū)域，這些cfDNA來源的5hmC生物標(biāo)志物比傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物具有更高的檢測(cè)靈敏度[35]。已有科學(xué)家在組織特異性、癌癥特異性的甲基化區(qū)域觀察到了5hmC的顯著富集[36]，因此，5hmC動(dòng)力學(xué)的全基因組分析進(jìn)一步完善我們對(duì)癌癥和甲基化之間關(guān)系的理解。

3.2 5hmC在癌癥診斷中的潛在應(yīng)用

近年來隨著生活環(huán)境變化，癌癥發(fā)病率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡也趨于年輕化，因此，癌癥早篩的意義越來越大。5hmC作為潛在的癌癥生物標(biāo)志物，在癌癥患者的基因組中具有一定的分布與特征，這是5hmC作為癌癥早篩標(biāo)記的重要依據(jù)。已有研究表明，5hm C生物標(biāo)志物在乳腺癌的診斷、分子亞型預(yù)測(cè)中的得到了初步應(yīng)用[37,38]。5hmC表達(dá)水平的下降可以成為胃癌的特異性標(biāo)志物，這在胃癌早期診斷與預(yù)后治療中可發(fā)揮巨大潛力[39]。此外，在一組結(jié)腸癌患者組織研究中，結(jié)腸癌組織5hmC表達(dá)明顯低于癌旁組織，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[40]。由此可見，新型生物標(biāo)志物5hmC在臨床癌癥診斷中可以發(fā)揮極大的潛力，是未來臨床早癌篩查與癌癥預(yù)后的潛在技術(shù)手段。

4 展望

表觀遺傳學(xué)的發(fā)展可為癌癥早期診斷提供新思路，具有廣闊的前景。當(dāng)前的表觀遺傳學(xué)療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中已顯示出良好的反應(yīng)，在實(shí)體瘤中的診斷研究也在不斷探索中。毋庸置疑，基于cfDNA的5hmC標(biāo)記診斷法在癌癥早期診斷中具有重要意義，但由于5hmC檢測(cè)過程中存在著各種生物酶的序列依賴性，未來需要開發(fā)針對(duì)5hmC的酶促或化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，能夠以單堿基分辨率針對(duì)特定位置的5hmC進(jìn)行高分辨率檢測(cè)。所以，特定于5hmC的替代化學(xué)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行腫瘤早期診斷預(yù)計(jì)會(huì)成為未來研究的重點(diǎn)。

此外，活細(xì)胞中5hmC的成像也是未來研究的發(fā)展方向。5hmC的成像對(duì)于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)5hmC在細(xì)胞生理和病理過程中的作用具有重要意義。但至今為止，細(xì)胞中5hmC的成像研究還很少。發(fā)展基于新型納米材料(例如，金納米粒子和半導(dǎo)體量子點(diǎn))的生物傳感器，有望突破活細(xì)胞中5hmC成像研究的瓶頸，完成5hmC的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。