水稻抗白葉枯病近等基因系的抗性鑒定揭示基因聚合的多向性效應(yīng)

周俊飛,章 山,孫 婧,張 偉,高利芬

(江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院,湖北 武漢 430056)

水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性菌黃單孢菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)侵染引起的一類細(xì)菌性維管束病害,是對水稻產(chǎn)量最具破壞性的病害之一。利用抗病基因培育抗病品種是控制白葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效的手段[1]。目前,已經(jīng)鑒定了將近40個(gè)白葉枯病抗性基因,9個(gè)(Xa1[2]、Xa3/Xa26[3]、xa5[4-5]、Xa10[6]、xa13[7]、Xa21[8]、Xa23[9]、xa25[10]和Xa27[11])已經(jīng)被克隆。只有7個(gè)抗病基因Xa21、xa5、Xa7、Xa10、Xa27、Xa23和Xa27相應(yīng)的無毒基因(avr基因)被分離。有意思的是,其中的5個(gè)avr基因(avrxa5、avrXa7、avrXa10[6]、avrXa23[12]和avrXa27[11])都屬于TAL效應(yīng)子(Effector),它是由黃單胞菌通過細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一類細(xì)菌蛋白質(zhì),作為轉(zhuǎn)錄因子,通過結(jié)合目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)來激活植物基因的表達(dá)[13]。由于水稻宿主和致病菌的協(xié)同進(jìn)化,在植物抗病基因與病原菌avr基因的互作壓力下,病原菌通過偽裝、多樣化avr基因或獲得額外的效應(yīng)子來避免相應(yīng)的抗病基因的識(shí)別,從而使得單個(gè)抗病基因提供的抗性很容易被克服[14]。例如,Xa4大面積長期應(yīng)用后,導(dǎo)致白葉枯菌小種進(jìn)化,抗病品種已經(jīng)喪失了抗性[15];xa5對含有TAL效應(yīng)基因pthXo1的菌株無效[16];P6小種不能感染攜帶Xa21的抗病品種,但是在P6的raxX基因缺失或raxST基因突變后能夠克服Xa21介導(dǎo)的抗病反應(yīng)[17]。

基因聚合是培育具有持久和廣譜抗性等優(yōu)良性狀后代的有效策略。例如Xa21+xa13的聚合系抗性明顯高于僅含有一個(gè)抗病基因的水稻[18]。Xa7和Xa21[19],Xa21、Xa4和Xa23[20],xa5、xa13和Xa21[21]等白葉枯抗病基因累加后,抗性增加,抗譜拓寬。不僅如此,白葉枯病抗性基因與其他基因聚合后,可增加對其他病蟲害的額外抗性。例如含Xa23與稻瘟病抗病基因的基因聚合水稻系同時(shí)獲得了對白葉枯病和稻瘟病的抗性[22]。含Xa23與細(xì)菌性條斑病抗性基因Rxol的基因聚合水稻系同時(shí)抗白葉枯病和細(xì)菌性條斑病[23]。Xa21、Bt基因與幾丁質(zhì)酶基因的三基因聚合系IR72則同時(shí)抗白葉枯病、紋枯病和蟲害[24]?？共』蚪M合后呈現(xiàn)正向的抗性累加效應(yīng)是育種家所期望的,然而,并非所有的抗病基因組合都能獲得正向的抗性疊加效應(yīng)。比如,Xa27介導(dǎo)的抗性在xa5和Xa27雙基因純合系中大大減弱[25];同樣,在xa5和Xa10雙基因純合植株中,依賴于avrXa10的Xa10的表達(dá)和Xa10介導(dǎo)的對PXO99A的抗性都被部分抑制[6];在xa5和Xa23雙基因純合植株中,avrXa23誘導(dǎo)的Xa23表達(dá)完全喪失,Xa23介導(dǎo)的抗性水平也降低[26]。

通過分子標(biāo)記輔助回交選育的含單抗病基因和基因組合的近等基因系(NILs),為研究抗病基因的功能提供了珍貴的材料。前期研究中,揭示了xa5和Xa21單基因抗病系和基因累加系的抗性正向疊加效應(yīng),本研究繼續(xù)報(bào)道了xa3、Xa23單基因抗病系以及xa5、Xa4、Xa21和xa13等基因聚合系的抗譜。通過比較分析8個(gè)致病菌對這些抗病系的致病性,揭示了單個(gè)抗病基因和基因組合后的抗病效應(yīng)的不確定性以及致病菌的毒性變異。研究結(jié)果為水稻抗病系培育和水稻種植布局提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究所用的水稻材料包括對白葉枯菌敏感的粳稻品種TP309和秈稻品種IR24,單基因抗病系IRBB3、IRBB5、IRBB21、CBB23,多抗病基因聚合系IRBB50、IRBB54和IRBB59。所有IR系列水稻的遺傳背景都是IR24。IRBB3、IRBB5、IRBB21是分別含Xa3、xa5和Xa21的單抗病基因近等基因系[27];IRBB50、IRBB54和IRBB59是分別含Xa4+xa5、Xa21+xa5、Xa21+xa5+xa13基因組合的多抗病基因近等基因系[28-29]。CBB23是以感病秈稻品種JG30為輪回親本,通過5代回交選育的攜帶Xa23基因的單抗病基因系[30]。

1.2 革蘭氏陰性菌黃單孢菌的培養(yǎng)和水稻抗譜鑒定

將江漢大學(xué)保存的8個(gè)來自菲律賓的白葉枯菌小種(P1:PXO61、P2:PXO86、P3:PXO79、P4:PXO7、P6:PXO99、P7:PXO145、P8:PXO280和P10:PXO124)在PSA培養(yǎng)基(土豆300 g/L、蔗糖 15 g/L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g/L、瓊脂15 g/L)上活化,刮取活化后的菌斑用無菌水制備成濃度約為109個(gè)細(xì)胞/mL的菌液用于水稻品種的抗性鑒定。在水稻生長的高分蘗期,用剪葉法[31]進(jìn)行接種。每個(gè)小種接種5株,每株接種3～5個(gè)葉片。接種12 d后,對病斑長度進(jìn)行測量,每個(gè)小種至少測量10個(gè)葉片。病斑長度用于評(píng)價(jià)抗病系的抗性水平,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)病害分級(jí)系統(tǒng),病斑長度≤3 cm表示抗病(R),3～6 cm 表示中度抗病(MR),6～10 cm表示中度感病(MS),≥10 cm 表示感病(S)[32]。

1.3 抗性基因的分子標(biāo)記檢測

為了確保所種植的抗病系含有相應(yīng)的抗病基因,對抗病系IRBB3、IRBB5、IRBB21、IRBB50、IRBB54和IRBB59所含有的抗病基因進(jìn)行了分子標(biāo)記輔助檢測。對xa5的檢測采用的是CAPS標(biāo)記xa5-XhoⅠ F/R[33],Xa21使用的是Gao等[34]開發(fā)的一個(gè)功能標(biāo)記U1/I2,Xa3使用的是功能標(biāo)記BB3-RF/R[35],特異的在抗性材料里擴(kuò)增;Xa4使用的是緊密連鎖的SSR標(biāo)記RM224[36],Xa23使用的是共分離標(biāo)記Lj74[37]。具體的引物序列和預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度見表1。

表1 抗病基因分子標(biāo)記檢測引物

2 結(jié)果與分析

2.1 接種試驗(yàn)檢測8個(gè)小種的有效致病性

為了保證接種的有效性,在進(jìn)行接菌試驗(yàn)時(shí),對不含有以上抗病基因的受體品種IR24和另外一個(gè)感病粳稻品種TP309同時(shí)進(jìn)行了接種。IR24的接種結(jié)果在之前的研究中已經(jīng)報(bào)道[34]。IR24對8個(gè)小種都表現(xiàn)出明顯的感病表型,其中被P8感染后的葉片病斑長度最長,有20～25 cm,而P6的病斑長度最短,僅有3～6 cm(圖1-B和文獻(xiàn)[34]的表1,S1)。TP309在受到8個(gè)小種侵染后,被P8侵染后的葉片病斑最長,平均長約19 cm,被P6侵染后的葉片病斑長度最短(圖1)。對TP309和IR24的接種結(jié)果表明,8個(gè)小種都具備致病性,且P8小種的致病力最強(qiáng),這8個(gè)小種可以用于抗性品種的抗譜分析。

A.8個(gè)小種在TP309上致病的圖像;B.8個(gè)小種在TP309和IR24上誘導(dǎo)的病斑長度。P1-P10.Xoo 小種。

2.2 分子標(biāo)記輔助檢測抗病系的真實(shí)性

采用xa5-XhoⅠ F/R、U1/I2、BB3-RF/RR、RM224和Lj74引物,分別對單基因系和聚合基因系中的xa5、Xa21、Xa3、Xa4和Xa23進(jìn)行分子標(biāo)記檢測。檢測結(jié)果如圖2所示,以不含目標(biāo)抗病基因的IR24為對照,IRBB3中能檢測到Xa3基因,IRBB5、IRBB50、IRBB54和IRBB59均能檢測到xa5基因,IRBB50中能檢測到Xa4基因,IRBB21、IRBB54和IRBB59中均能檢測到Xa21基因;而以不含Xa23基因的C418為對照,CBB23中能檢測到Xa23基因。分子標(biāo)記的檢測結(jié)果證明了試驗(yàn)材料的真實(shí)可靠。

CK.雙蒸水為模板。IR24、C418.陰性對照;IRBB3、IRBB5、IRBB21、CBB23、IRBB50、IRBB54和IRBB59.抗病近等基因系。

2.3 單基因抗譜揭示病原菌毒性變異

在前期的研究中,報(bào)道了xa5和Xa21基因?qū)?個(gè)小種的抗性,xa5對所有8個(gè)小種表現(xiàn)出抗性,而Xa21對P2、P3、P4和P6表現(xiàn)出抗性,對P1、P7和P10中度感病,對P8則完全敏感[34]。本研究中,進(jìn)一步報(bào)道了Xa3和Xa23單基因抗病系的抗譜。結(jié)果如圖3所示,單基因抗病系中,IRBB3的整體抗性最弱,對P1、P2、P3、P4、P6和P10中度感病,對P7和P8完全感病;而8個(gè)小種在CBB23葉片上誘導(dǎo)的病斑長度都不足1 cm,CBB23對白葉枯菌表現(xiàn)出了明顯的廣譜高抗性。值得注意的是,在之前的報(bào)道中,發(fā)現(xiàn)P8打破了Xa21基因介導(dǎo)的抗性,在IRBB21上誘導(dǎo)超過10 cm長的病斑[34]。本研究中,P8在2個(gè)感病對照TP309和IR24,以及單基因抗病系IRBB3上誘導(dǎo)的病斑長度都是8個(gè)小種中最長的,表現(xiàn)出最強(qiáng)的致病性。這個(gè)結(jié)果表明,在長期的病原菌和寄主互作中,P8克服了多個(gè)抗病基因介導(dǎo)的抗性,同樣地,其他小種也有可能發(fā)生致病性的變化,因此,有必要對常用小種的致病性進(jìn)行鑒定,以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)毒性變異的致病菌。

A.8個(gè)小種在近等基因系上致病的圖像;B.8個(gè)小種在近等基因系上誘導(dǎo)的病斑長度。P1，P2，P3，P4，P6，P7，P8，P10.Xoo小種。TP309和IR24.感病對照; IRBB3、IRBB21、IRBB5、CBB23.單基因抗病系;IRBB54、IRBB50和IRBB59.多基因抗病系。

2.4 基因聚合后的抗性疊加效應(yīng)

xa5+Xa21基因聚合后對8個(gè)小種都表現(xiàn)出正向的抗性疊加效應(yīng)[34]。而xa5與Xa4基因聚合后正向的抗性疊加效應(yīng)不明顯(圖3)?；蚓酆舷抵锌剐哉虔B加效應(yīng)最顯著的是含xa5+Xa21+xa13三基因組合的IRBB59。IRBB59和CBB23一樣,8個(gè)小種在IRBB59葉片上誘導(dǎo)的病斑長度都不足1 cm,表現(xiàn)出明顯的廣譜高抗性(圖3)。xa5+Xa21、xa5+Xa4、xa5+Xa21+xa13的基因組合對P8的抗性都達(dá)到高抗病的水平,表明了上述基因組合能有效抵御P8的侵染,也說明了基因聚合策略對選育持久廣譜抗性水稻品種的有效性。

3 討論與結(jié)論

Zhang等[30]報(bào)道顯示IRBB21對10個(gè)菲律賓小種中的P10敏感，對其余9個(gè)小種都具有抗性。而在我們的之前研究中，IRBB21對P10中度感病，對P8則完全敏感[34]。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRBB3對P1、P2、P3、P4達(dá)到了中度感病的水平，而Xiang等[38]的報(bào)道顯示，攜帶Xa3的水稻品種對P1、P2、P3、P4、P5和P9都表現(xiàn)出抗性的表型。這些結(jié)果表明,不同實(shí)驗(yàn)室保存命名的相同的小種在致病性上不一定完全相同,這種情況或是由于培養(yǎng)條件的不同,使得小種在保存的過程中發(fā)生了突變,亦或是在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)了操作失誤,導(dǎo)致常用的小種混淆或是污染等,可以在后續(xù)的研究中繼續(xù)關(guān)注。

P8對Xa21介導(dǎo)抗性的突破以及其他抗病基因,比如Xa4[15]抗性被突破的事實(shí),提示育種家關(guān)注單個(gè)抗病基因抵御水稻病害的時(shí)效性。由于植物和病原菌的協(xié)同進(jìn)化,大面積長時(shí)間的種植含單個(gè)基因的抗性品系容易導(dǎo)致抗性喪失,聚合育種是增加抗性、減緩抗性喪失的有效手段。單基因系IRBB21對4個(gè)菲律賓小種(P1、P7、P8和P10)的抗性已明顯減弱,而Xa21在和xa5聚合后對以上4個(gè)小種的抗性明顯提高[34]。Xa21+xa5+xa13的組合更是對所有小種產(chǎn)生了高抗性,病斑長度均不足1 cm。但是,在進(jìn)行基因組合時(shí),還是要充分考慮2個(gè)基因的作用機(jī)制。xa5和Xa21、xa13聚合后,表現(xiàn)出了正向的抗性疊加效應(yīng),是育種家所期望的。而在之前的報(bào)道中,xa5和Xa23/Xa10/Xa27基因聚合后,聚合系的抗性都出現(xiàn)了一定程度的弱化[6,25-26]。根據(jù)本研究和前人研究結(jié)果,Xa23單基因已經(jīng)可以對常用的白葉枯菌提供廣譜高抗性[30],和xa5的聚合反而弱化了Xa23的功能。推測其原因,Xa23、Xa10和Xa27基因的一個(gè)共同特點(diǎn)是相應(yīng)的avr基因都是TAL效應(yīng)子。TAL效應(yīng)子是由黃單胞菌通過細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一類細(xì)菌蛋白質(zhì),作為轉(zhuǎn)錄因子,通過結(jié)合植物基因的啟動(dòng)子區(qū)來激活植物基因的表達(dá),Xa23、Xa10和Xa27的表達(dá)都依賴于其相應(yīng)的avr基因。以Xa27基因?yàn)槔?AvrXa27結(jié)合在Xa27的啟動(dòng)子區(qū),誘導(dǎo)其表達(dá)使植株產(chǎn)生抗病性,AvrXa27誘導(dǎo)的Xa27的表達(dá)需要顯性Xa5的參與。在隱性xa5和Xa27雙基因純合聚合系中,隱性xa5不能行使顯性Xa5的功能,Xa27的激活被弱化,從而使Xa27介導(dǎo)的抗病反應(yīng)減弱[25]。xa5和Xa21的基因聚合后,2個(gè)基因在聚合系IRBB54中的表達(dá)都要高于單基因系[34]。xa5和Xa21基因聚合后的抗性增強(qiáng)效應(yīng)可能也與Xa21和Xa27不同的抗病機(jī)制有關(guān)。Xa21屬于組成型表達(dá)基因,表達(dá)不依賴于顯性Xa5的功能。因此,為提高抗性、拓寬抗譜、延緩抗性喪失,聚合育種最好選擇具有不同抗病機(jī)制的基因進(jìn)行組合。

本研究調(diào)查了多個(gè)單基因抗病系和基因組合抗病系對8個(gè)常用的白葉枯病小種的抗性水平,研究結(jié)果一方面鑒定了各個(gè)抗病系的抗譜,另一方面也揭示了常用致病菌的毒性變異以及基因聚合策略在應(yīng)付致病菌毒性變異的有效性和可能出現(xiàn)的拮抗效應(yīng),在水稻白葉枯病的理論研究和應(yīng)用研究中應(yīng)充分考慮這些因素。