雙孢蘑菇培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素利用及相關(guān)酶活性變化的研究

楊亞茹，張國慶，陳青君*，蔡盼盼，王清輝，楊世麗

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京 102206；2.承德興春和農(nóng)業(yè)股份有限公司，承德 068250；3.邢臺市蔬菜站，邢臺 054000)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)簡稱雙孢蘑、雙孢菇，俗稱蘑菇[1]。栽培雙孢蘑菇的培養(yǎng)料(堆肥)由作物秸稈(如黍草、稻草和玉米秸稈)、動物糞便(如馬糞、牛糞和雞糞)和石膏等通過隧道發(fā)酵而成[2-3]。培養(yǎng)料的理化性質(zhì)通常作為實際生產(chǎn)中監(jiān)控其質(zhì)量優(yōu)劣、預(yù)測產(chǎn)量的重要指標。荷蘭是雙孢蘑菇栽培技術(shù)最為先進的國家，對培養(yǎng)料理化參數(shù)有科學(xué)的評價指標[4]。中國的雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)有了飛速的發(fā)展，利用不同的原料制作培養(yǎng)料均獲得較好的效果[5]。

雙孢蘑菇培養(yǎng)料的主要成分秸稈是木質(zhì)纖維素，其生產(chǎn)過程是對木質(zhì)纖維素的降解轉(zhuǎn)化過程[6-7]。實現(xiàn)對木質(zhì)纖維素的充分降解利用，是工廠化蘑菇生產(chǎn)面臨的重要課題[5]。木質(zhì)纖維素由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素構(gòu)成，依據(jù)其組成元件，可將木質(zhì)纖維素降解酶劃分為纖維素降解酶系、半纖維素降解酶系和木質(zhì)素降解酶系[8]。纖維素降解酶系包括羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，CMC)、α-纖維二糖酶(α-cellobiase)等；半纖維素降解酶系包括木聚糖酶(xylanase)、木糖苷酶(xylosidase)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-arabinofuranosidase)等；木質(zhì)素的主要降解酶為漆酶(laccase)等；堆肥中酶的活性影響纖維素、半纖維素的降解[9]，這些大分子物質(zhì)必須經(jīng)相應(yīng)的酶分解成葡萄糖、果糖等單糖類和小分子化合物后才能被吸收利用，為雙孢蘑菇生長提供所需的碳源[10]。以小麥秸稈為主料在一次發(fā)酵期間，纖維素和木聚糖被降解程度有限；在二次發(fā)酵期間，高達50%的物料碳水化合物被代謝[11]。Chen等[12]、Yama等[13]報道，在堆肥過程中纖維素被降解，在出菇時期主要利用木質(zhì)素。李曉博等[14]發(fā)現(xiàn)酶活性與木質(zhì)纖維素降解呈正相關(guān)，酶活性高降解速率就快，酶活性低降解速率就慢。盡管前人對木質(zhì)纖維素組分變化及部分酶活性有研究報道，但對于雙孢蘑菇全部生產(chǎn)過程中木質(zhì)纖維素利用規(guī)律尚不清晰。

該研究采用隧道式發(fā)酵技術(shù)，在測定堆肥時期(建堆、一次發(fā)酵的3次翻堆、二次發(fā)酵)和栽培時期(菌絲長滿，原基形成，第1潮菇、第2潮菇、第3潮菇)理化指標(pH值、EC值、含水量、含碳量、含氮量、灰分含量、碳氮比)的基礎(chǔ)上，對木質(zhì)纖維素各組分含量和酶活性進行系統(tǒng)分析，同時統(tǒng)計產(chǎn)量和生物學(xué)效率，為雙孢蘑菇工廠化栽培建立更為科學(xué)的指標評價體系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗在河北省承德興春和農(nóng)業(yè)股份有限公司雙孢蘑菇工廠進行，雙孢蘑菇菌種為A15。

1.2 試驗方法

1.2.1 堆肥和雙孢蘑菇栽培 采取3批次培養(yǎng)料，試驗原料按照碳氮比(30∶1)[15]的原則配方。

第1批次(T1)配方是黍草30 t、稻草30 t、雞糞60 t、豆粕2 t、石膏4 t；

第2批次(T2)配方是黍草35 t、稻草30 t、雞糞60 t、豆粕2 t、石膏4 t；

第3批次(T3)配方是黍草36 t、稻草24 t、雞糞55 t、豆粕2 t、石膏4 t。

通過雙孢蘑菇專用空調(diào)和PLC智能化控制系統(tǒng)嚴格控制和調(diào)節(jié)不同生長時期的溫度和濕度、CO2濃度和風(fēng)壓風(fēng)量。菌絲生長時期培養(yǎng)料溫度控制在23～25 ℃，空氣達到飽和含水量，CO2保持在0.5%～1%；子實體生長時，菇房室內(nèi)溫度保持在16～18 ℃，空氣相對濕度85%～95%，CO2保持在0.08%左右。每批次菇床面積為900 m2，統(tǒng)計每批次菇房產(chǎn)量。

1.2.2 取 樣 堆肥時期培養(yǎng)料取樣方法：分別在建堆(BM)、一次發(fā)酵(PI)(包括2次倒倉PI-1、PI-2和一次發(fā)酵結(jié)束PI-3)和二次發(fā)酵結(jié)束后(PII)取樣。取樣時在隧道前中后的斷面上分8個點共采集培養(yǎng)料1～2 kg，培養(yǎng)料混合均勻后部分用于基本理化性質(zhì)測定，約100 g保存在液氮中，用于相關(guān)降解酶活性測定。部分培養(yǎng)料置于-20 ℃冰箱保存，用于培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素組分含量測定。

栽培時期培養(yǎng)料取樣方法：在菌絲長滿(Filling)，原基形成(Pinning)，第1潮菇、第2潮菇、第3潮菇(1st、2nd、3rd)取樣，取樣點在第2層床架的隨機3個位點，采樣深度為培養(yǎng)料上中層10 cm(除去覆土層)，取樣300 g左右，將3點的培養(yǎng)料混合均勻。取部分培養(yǎng)料用于基本理化性質(zhì)測定，約100 g保存在液氮中，用于相關(guān)降解酶活性測定。余下培養(yǎng)料置于-20 ℃冰箱保存，用于培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素組分含量測定。

1.2.3 培養(yǎng)料理化性質(zhì)的測定 使用pH計和電導(dǎo)率儀測定pH值和EC值。采用干燥稱重法測定含水量、半自動凱氏定氮法測定含氮量，灼燒重量法測定含碳量和灰分并計算碳氮比。

1.2.4 木質(zhì)纖維素含量測定 采用濾袋法測定培養(yǎng)料的纖維素和半纖維素含量，Jurak[16]的方法測定木質(zhì)素的含量。

1.2.5 木質(zhì)纖維素相關(guān)酶活性的測定 粗酶液的制備：取3.0 g培養(yǎng)料，加入30 mL的生理鹽水，25 ℃、220 r/min振蕩懸搖2 h，4層紗布過濾后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液。

以羧甲基纖維素鈉作為降解底物測定粗酶液的羧甲基纖維素酶活性；以木聚糖作為降解底物測定粗酶液的木聚糖酶活性，酶活性的定義以每分鐘釋放1 μmol的葡糖糖/木糖所需要的酶量(U/g)；以對硝基苯酚為降解底物，測定α-纖維二糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、木聚糖酶的活性，酶活性的定義以每分鐘釋放1 μmol的對硝基苯酚所需要的酶量(U/g)。運用ABTS法測定粗酶液的漆酶活性，酶活性的定義以每分鐘、每毫升反應(yīng)體系產(chǎn)生一個吸光值所需要的酶量(U/g)。

1.2.6 計算雙孢蘑菇產(chǎn)量和生物學(xué)效率 分別統(tǒng)計每個生產(chǎn)批次每潮菇的產(chǎn)量，并計算雙孢蘑菇的生物學(xué)效率。

生物學(xué)效率(%)=蘑菇鮮質(zhì)量(g)/培養(yǎng)料干質(zhì)量(g)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)料的理化性質(zhì)

保持在適宜范圍的理化參數(shù)是雙孢蘑菇正常產(chǎn)出的前提。表1為雙孢蘑菇工廠化生產(chǎn)時使用3批次基本相同的配方在堆肥時期的理化性質(zhì)。pH值在一次發(fā)酵時先升高后降低，尤其是第1批次和第2批次都是從堆肥時期就開始升高到第2次翻堆pH達到最高分別是9.42和8.03，然后從一次發(fā)酵結(jié)束(PI-3)到二次發(fā)酵(PII)結(jié)束后pH逐漸降低。EC值從建堆(BM)到一次發(fā)酵(PI)再到二次發(fā)酵(PII)都呈逐漸下降趨勢，堆肥時期EC值變化不大；含水量從建堆(BM)到一次發(fā)酵(PI)保持在73.53%～77.03%，經(jīng)過二次發(fā)酵結(jié)束之后(PII)降至67.93%；含碳量整體呈下降趨勢，從建堆(BM)到一次發(fā)酵第1次翻堆(PI-1)稍有升高，之后逐漸下降；含氮量從建堆(BM)到二次發(fā)酵(BM～PII)逐漸增加，從1.37增加到1.98；灰分含量整體趨勢逐漸增加，但是從建堆(BM)到一次發(fā)酵第1次翻堆(PI-1)稍有降低，之后逐漸升高。碳氮比從建堆的29.21到二次發(fā)酵結(jié)束的17.7呈下降趨勢。3批次培養(yǎng)料理化性狀指標均在適宜范圍，為產(chǎn)量形成和木質(zhì)纖維素分析提供良好的基礎(chǔ)。

表1 3批次培養(yǎng)料堆肥時期理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of three batches of samples during composting

表2是3批次培養(yǎng)料在栽培時期的理化性質(zhì)。從菌絲長滿(Filling)到第3潮菇(3rd)結(jié)束pH、含水量、含碳量、碳氮比呈逐漸下降趨勢；EC值從菌絲長滿(Filling)到第2潮菇(2nd)結(jié)束呈逐漸上升趨勢?；曳趾繌木z長滿到第3潮菇結(jié)束逐漸上升，含氮量從菌絲長滿的2.08到第3潮菇結(jié)束的2.03，整體變化不大。

表2 3批次培養(yǎng)料栽培時期理化性質(zhì)Tab.2 Physical and chemical properties of three batches of samples during cultivation

2.2 培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素相對含量變化

圖1為培養(yǎng)料不同時期木質(zhì)纖維素相對含量的變化。整體上看，3批次培養(yǎng)料不同時期的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的相對含量變化趨勢一致。在一次發(fā)酵時，半纖維素相對含量從19.64%降至16.67%，下降了2.97%；在二次發(fā)酵結(jié)束后相對含量降至10.93%，下降了5.74%，顯著高于一次發(fā)酵；纖維素相對含量在一次發(fā)酵時維持在23.19%左右，二次發(fā)酵結(jié)束后降至15.73%，下降了7.46%，顯著高于一次發(fā)酵；木質(zhì)素經(jīng)過一次發(fā)酵、二次發(fā)酵從16.12%增加至22.96%，相對含量顯著增加，這可能與培養(yǎng)料的能量損失有關(guān)，表明堆肥時期木質(zhì)素幾乎沒有被利用。從菌絲長滿到第1潮菇時，半纖維素和纖維素相對含量有少量降低，半纖維素相對含量從7.71%降至4.73%，纖維素相對含量從13.96%降至10.31%；木質(zhì)素相對含量從21.16%降至19.08%，三者均有所下降；出菇之后總碳水化合物的相對含量變化不明顯，第3潮菇甚至有所增加，第2潮菇到第3潮菇半纖維素相對含量從3.87%增加到4.27%，纖維素相對含量從8.32%增加到8.37%，木質(zhì)素相對含量從18.64%增加到18.98%?？傮w分析，纖維素和半纖維素在二次發(fā)酵時下降最多，木質(zhì)素在堆肥時期幾乎沒有被利用，第1潮菇時3種成分均顯著下降。

2.3 木質(zhì)纖維素相關(guān)降解酶活性的變化

3批次培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素相關(guān)降解酶活性變化如圖2所示。圖2A、圖2B均為降解纖維素的酶。羧甲基纖維素酶活性從建堆時到一次發(fā)酵結(jié)束都趨于相對穩(wěn)定，一次發(fā)酵到二次發(fā)酵期間略有上升，上升至13.21 U/g，在二次發(fā)酵到原基形成略有

下降，下降至11.02 U/g，在第1潮菇時突然升高達到149.52 U/g，之后降低，第3潮菇降至69.42 U/g；α-纖維二糖酶活性在一次發(fā)酵時變化不大，在0.52 U/g左右，從一次發(fā)酵到二次發(fā)酵略有上升，從二次發(fā)酵結(jié)束到原基形成時又緩慢上升，從0.81 U/g升到1.56 U/g，第1潮菇時突然升高至13.30 U/g，之后緩慢降低，第3潮菇時降至7.75 U/g。由此可知，降解纖維素的2種酶在堆肥時期活性都相對平穩(wěn)，栽培時期由于雙孢蘑菇菌絲的旺盛生長，在第1潮菇時急速升高，以后逐漸下降，其中羧甲基纖維素酶的活性(11.02～149.52 U/g)要高于α-纖維二糖酶活性(0.37～13.30 U/g)，是降解纖維素的主要酶類。

圖2C、圖2D、圖2E分別為木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶在蘑菇生長不同時期的活性變化，三者與培養(yǎng)料半纖維素的降解有關(guān)。木聚糖酶活性在堆肥時期維持66.09 U/g左右，在一次發(fā)酵的3次翻堆活性略有起伏，在二次發(fā)酵略有下降，從發(fā)菌時期開始活性顯著提高，達140.43 U/g，不斷升高，在第1潮菇達176.25 U/g，之后下降至145.73 U/g；木糖苷酶活性在一次發(fā)酵時變化明顯，其中第2次倒倉時活性較高，由1.19 U/g升至1.92 U/g，之后呈下降趨勢直至原基形成的0.55 U/g，又在第1潮菇時活性突然升高至5.07 U/g，之后一直下降，第3潮菇降至2.80 U/g；α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性在堆肥時期的變化趨勢與木糖苷酶活性相似，但是在一次發(fā)酵活性變化起伏較大，尤其是第2次倒倉時活性較高，達8.64 U/g，之后下降，二次發(fā)酵結(jié)束后降至5.27 U/g，在菌絲長滿時突然升高至37.45 U/g，至原基時一直維持較高活性，之后在第1潮菇、第2潮菇、第3潮菇緩慢下降至34.52 U/g。由此可見，降解半纖維素的3種酶，在堆肥時期就具有一定的活性，其中木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶在一次發(fā)酵第2次倒倉過程中活性較高。在出菇時期，3種酶在第1潮菇時活性都達到最高，其中α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性在雙孢蘑菇菌絲長滿時就已經(jīng)達到較高水平。3種酶中木聚糖酶的活性(58.65～176.25 U/g)要高于木糖苷酶活性(0.55～5.07 U/g)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性(2.29～39.60 U/g)，這3種酶是分解半纖維素的主要酶類。

圖2F為培養(yǎng)料不同時期漆酶活性的變化趨勢，漆酶是降解木質(zhì)素的酶。在堆肥時期漆酶幾乎沒有活性，在雙孢蘑菇菌絲長滿時活性突然升高至14.57 U/g，并在原基形成時保持較高活性，在第1潮菇時突然下降至0.70 U/g，之后又升高，第3潮菇升至14.03 U/g。3批次培養(yǎng)料各種酶活性的變化趨勢基本一致。

從不同時期幾種酶活性高低分析可知，在菌絲長滿時分解半纖維素的木聚糖酶活性和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性就達到高值，之后持續(xù)在高水平，而分解纖維素的羧甲基纖維素酶和α-纖維二糖酶在第1潮菇時才達到較高的水平，漆酶在發(fā)菌時期和原基形成時較高，表明雙孢蘑菇菌絲最先對半纖維素和木質(zhì)素分解，而后對纖維素分解。

2.4 雙孢蘑菇的產(chǎn)量和生物學(xué)效率

表3為3批次雙孢蘑菇產(chǎn)量與生物學(xué)效率。雙孢蘑菇總產(chǎn)量分別為20.08、20.28和25.98 kg/m2，生物學(xué)效率分別為52.05%、49.86%、71.03%。第3批次的生物學(xué)轉(zhuǎn)化效率明顯高于第1批次、第2批次。

表3 蘑菇產(chǎn)量與生物學(xué)效率Tab.3 The yield and biological efficiency of mushroom

3 討 論

堆肥質(zhì)量是雙孢蘑菇的生長和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。從3批次培養(yǎng)料的理化性質(zhì)pH、EC、含氮量和含水量等都在雙孢蘑菇培養(yǎng)料要求的范圍內(nèi)，與前人報道一致[17]。有研究表明，播種時(二次發(fā)酵結(jié)束)培養(yǎng)料的含氮量與蘑菇的產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)，堆肥時期含水量是一個非常關(guān)鍵的因素[18]。該試驗中第3批次生物學(xué)轉(zhuǎn)化效率高于第1批次和第2批次，可能與其二次發(fā)酵的含水量、含氮量較高有關(guān)。

該試驗3批次培養(yǎng)料不同時期的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的相對含量變化趨勢基本一致。堆肥時期在一次發(fā)酵時，半纖維素和纖維素相對含量降低3%左右，在二次發(fā)酵結(jié)束后下降更明顯分別為7.46%和5.74%；出菇時期從菌絲長滿到第1潮菇時半纖維素、纖維素、木質(zhì)素相對含量均下降了3%左右，其中木質(zhì)素相對含量在堆肥時期沒有下降，在菌絲長滿至原基形成時下降顯著，與漆酶活性在這一時期達到高峰相吻合，表明雙孢蘑菇菌絲生長時期分泌大量的漆酶，降解木質(zhì)素。雖然雙孢蘑菇屬于典型的草腐型食用菌，但其分解木質(zhì)素的能力在發(fā)菌時期較強，表明雙孢蘑菇不僅利用纖維素、半纖維素，對木質(zhì)素也很需要，這與Zhang[19]的研究結(jié)果一致。

不同時期木質(zhì)纖維素的酶活性變化與木質(zhì)纖維素各組分的降解有密切的關(guān)系。堆肥時期半纖維素、纖維素相對含量顯著降低，此時期的羧甲基纖維素酶、α-纖維二糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶皆有一定的活性；堆肥時期木質(zhì)素相對含量變化不明顯，漆酶的活性比較低；出菇時期，在菌絲長滿至第1潮菇時，雙孢蘑菇菌絲體表現(xiàn)出較高的基質(zhì)降解能力，尤其是漆酶活性自接種后激增，纖維素酶(羧甲基纖維素酶、α-纖維二糖酶)在原基形成時激增，半纖維素酶(木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶)在菌絲長滿時顯著升高，第1潮菇時劇增，這一時期的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素相對含量顯著下降。而第2潮菇之后隨著各種酶活性的降低，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的相對含量幾乎沒有下降，反而略有升高，Jurak等[16]的研究認為，由于酶活性的降低，木聚糖側(cè)鏈殘基積累影響纖維素、半纖維素的降解，該試驗結(jié)果與其一致。該試驗第1潮菇時產(chǎn)量最高，第2潮菇減產(chǎn)，第3潮菇產(chǎn)量最低，與Patyshakuliyeva等[20]的研究一致。試驗3批次培養(yǎng)料中以第3批次二次發(fā)酵結(jié)束后的木聚糖酶活性(67.68 U/g)、羧甲基纖維素酶活性(15.16 U/g)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性(8.35 U/g)、木糖苷酶活性(1.58 U/g)、α-纖維二糖酶活性(1.23 U/g)高于第1批次和第2批次，其產(chǎn)量表現(xiàn)最好，這與蔡盼盼[10]對10批次蘑菇二次發(fā)酵培養(yǎng)料酶活性與產(chǎn)量的相關(guān)分析結(jié)果一致。木質(zhì)纖維素酶測定速度快、結(jié)果準確，以酶活性來評價二次發(fā)酵培養(yǎng)料的質(zhì)量和預(yù)測產(chǎn)量具有一定的實用性，在試驗測試條件較好的生產(chǎn)企業(yè)可以開發(fā)利用。

4 結(jié) 論

3批次培養(yǎng)料的理化性狀在雙孢蘑菇生長適宜范圍，在堆肥時期纖維素、半纖維素被大量利用，以二次發(fā)酵時期其相對含量下降最顯著，分別為7.46%和5.74%。在栽培時期，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量均下降了3%左右。各種降解酶在堆肥時期活性平穩(wěn)，菌絲長滿至第1潮菇時都急速升高，其中羧甲基纖維素酶的活性(11.012～149.52 U/g)遠高于α-纖維二糖酶活性(0.37～13.30 U/g)，是降解纖維素的主要酶類。木聚糖酶的活性(58.65～176.25 U/g)高于木糖苷酶活性(0.55～5.07 U/g)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性(2.29～39.60 U/g)，是分解半纖維素的主要酶類。漆酶在堆肥時期幾乎沒有活性，菌絲長滿至原基形成時活性高達14.57 U/g。3批次培養(yǎng)料中第3批次的各種酶活性、生物轉(zhuǎn)化率明顯高于第1批次和第2批次。各種酶活性與產(chǎn)量呈正相關(guān)。