一種利用熒光酶標(biāo)儀快速確立藥動學(xué)參數(shù)的方法

李知宗，劉驚濤，陳恒玲，林顯光

(中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院/腦認(rèn)知國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

1 引言

近年來，多肽類藥物在各類疾病中得到了快速發(fā)展。為了更加準(zhǔn)確地掌握藥物在體內(nèi)的吸收、代謝規(guī)律，就需要對其藥代動力學(xué)進(jìn)行研究。目前，對藥動學(xué)參數(shù)的研究大多采取HPLC、LC-MS，成本較高[1]。因此，本文利用熒光酶標(biāo)儀，對肽類藥物藥動學(xué)參數(shù)的確立進(jìn)行改良，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

2.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD大鼠，SPF級，體重180～200 g，購買于湖北省疾病預(yù)防控制中心。飼養(yǎng)于12h光照/12h黑暗的環(huán)境中，自由攝食飲水。動物實(shí)驗(yàn)與處理均遵照《中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物使用與福利指導(dǎo)手冊》。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)試劑如表1所示，主要儀器設(shè)備如表2所示。

表1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

表2 主要儀器設(shè)備

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 溶液的配制

(1)0.9%的生理鹽水：稱取4.5 g 氯化鈉溶于500 mL超純水中，滅菌后分裝。

(2)20%的溶液：稱量8 g 溶于40 mL的生理鹽水中，備用。

(3)熒光標(biāo)記肽COX52-69按每管2 mg分裝，避光環(huán)境下，每管溶于0.85 mL生理鹽水中，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2 設(shè)立陽性對照

實(shí)驗(yàn)前將大鼠斷糧12～16 h，飲水不限。將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)動物固定器中圖1(a)，鼠尾暴露于籠外。用橡皮筋或縫合線捆扎鼠尾根部，置于40 ℃熱水中5～10 s，使鼠尾靜脈充盈腫脹，易于顯現(xiàn)靜脈。右手持針，盡量使進(jìn)針處血管與針頭方向平行，針頭平行于鼠尾刺破表皮圖1(b)，若可見回血，則左手捏住鼠尾，右手推拉注射器活塞，制造負(fù)壓，抽取1.5 mL血液[2]。取血結(jié)束，用脫脂棉球按壓針眼部位30 s，確定止血后放開大鼠。

將取得的血液置于4 ℃冰箱中靜置2 h后，利用低溫高速離心機(jī)(1000 r/4°，10 mins)進(jìn)行離心，分離上層血清于新的EP管中，再用低速離心機(jī)(500 r/min)進(jìn)行復(fù)離，得到上層血清300 μL。避光環(huán)境下，精確稱取0.7 mg熒光標(biāo)記肽粉末，加入血清中，利用渦旋振蕩器混勻，作為陽性對照。將血清按照每孔50 μL加入96孔板，并將96孔板放入酶標(biāo)儀的測量小室中。調(diào)整酶標(biāo)儀的測量參數(shù)，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長521nm，測量時間100ms，激發(fā)帶寬12nm，并在測量前輕微震蕩板壁，使血清平鋪孔底。

圖1 大鼠尾靜脈取血

3.3 熒光肽COX52-69半衰期的測定

選取180～200 g 的SD大鼠，于實(shí)驗(yàn)前12～16 h斷糧，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與空白組。對所有大鼠進(jìn)行尾靜脈取血。取血完成后，實(shí)驗(yàn)組以2.5 mg/kg對大鼠腹腔注射熒光標(biāo)記肽COX52-69，空白組以2.5 mg/kg對大鼠腹腔注射生理鹽水。注射完成后，以2 g/kg對兩組大鼠灌胃20%的溶液，并將此刻記為零時刻。于15、30、45、60、75、90、105、120 min分別取靜脈血。將所有血液樣本于低溫避光環(huán)境下靜置2 h，利用低溫離心機(jī)分離上層血清。將血清按照每孔50 μL加入96孔板，并將96孔板放入酶標(biāo)儀的測量小室中。調(diào)整酶標(biāo)儀的測量參數(shù)，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長521 nm，測量時間100 ms，激發(fā)帶寬12 nm，并在測量前輕微震蕩板壁，使血清平鋪孔底[3]。將測得的熒光強(qiáng)度(RFU)按公式(1)轉(zhuǎn)化為血藥濃度。熒光標(biāo)記肽COX52-69濃度計(jì)算公式為：

(1)

4 結(jié)果與分析

腹腔注射熒光標(biāo)記肽COX52-69的血藥濃度-時間曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)

根據(jù)陽性對照對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行計(jì)算，利用DAS 2.0繪制所得腹腔注射熒光標(biāo)記肽COX52-69的血藥濃度-時間曲線及藥代動力學(xué)參數(shù)見圖2、表3。

5 結(jié)語

近年來，越來越多的多肽藥物被開發(fā)并用于臨床。多數(shù)已被FDA批準(zhǔn)并用于臨床的多肽類藥物具有用藥量少，選擇性強(qiáng)，特異性好，作用效果顯著，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[4]。COX52-69是從豬小腸中分離提取的一種短肽。為了更加準(zhǔn)確的掌握短肽COX52-69在體內(nèi)的吸收、代謝規(guī)律，就需要對其藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)對短肽COX52-69進(jìn)行修飾，在其N端連接綠色熒光素FITC，對大鼠進(jìn)行腹腔注射熒光標(biāo)記肽COX52-69，利用熒光酶標(biāo)儀對給藥后不同時段的大鼠血清進(jìn)行檢測[5]，通過陽性對照組求得大鼠血清的血藥濃度，利用DAS 2.0繪制血藥濃度-時間曲線。目前，對藥動學(xué)參數(shù)的研究大多采取HPLC、LC-MS，成本較高。該方法對肽類藥物藥動學(xué)參數(shù)的確立進(jìn)行改良，可以快速確立短肽COX52-69的藥代動力學(xué)參數(shù)，同時具有低成本的優(yōu)點(diǎn)。

利用DAS2.0對藥代動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行擬合，

表3 從大鼠血清中測得腹腔注射熒光標(biāo)記肽COX52-69的藥動學(xué)參數(shù)