HPLC法測定銀杏葉提取物中9種小分子有機(jī)酸類含量研究

陳艷杰

摘 要：通過多元統(tǒng)計分析測定銀杏葉提取物中部分有機(jī)酸成分含量。方法 采用色譜柱法等對9種小分子有機(jī)酸進(jìn)行分離，保持柱溫40℃對有機(jī)酸含量進(jìn)行線性關(guān)系考察，得到銀杏葉中幾種不同小分子有機(jī)酸含量;利用多元統(tǒng)計分析對試驗結(jié)果進(jìn)行驗證，得到各待測成分之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)等;利用方法學(xué)進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度試驗，明確試驗所得結(jié)論的科學(xué)性。結(jié)果 相同銀杏葉產(chǎn)區(qū)不同廠家所生產(chǎn)的銀杏葉提取物主成分含量存在差異;利用多元統(tǒng)計分析可以對成分差異以及內(nèi)在相關(guān)性進(jìn)行解讀，認(rèn)為兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸等是體現(xiàn)不同廠家銀杏葉提取物小分子有機(jī)酸含量差異的主要特征成分。

關(guān)鍵詞：多元統(tǒng)計分析;銀杏葉提取物;小分子有機(jī)酸;色譜柱法

中圖分類號：TU528.59 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? 文章編號：1001-5922（2021）12-0039-05

Determination of 9 Kinds of Small Molecular Organic Acids in Ginkgo Biloba Extracts by HPLC

Chen Yanjie

（Zhengzhou University of Industrial Technology， Zhengzhou 451150， China）

Abstract：Multivariate statistical analysis is adopted to determine the content of some organic acids in the Ginkgo biloba extracts. Chromatographic column is used to separate nine kinds of small molecular organic acids， and the column temperature is controlled at 40℃ to investigate the linear relationship of organic acid content. Thus the contents of several different small molecular organic acids in ginkgo biloba are obtained. Multivariate statistical analysis is utilized to verify the test results， and the standard curves and correlation coefficients of each component to be measured are obtained. The methodology is carried out to test the precision， stability， repeatability and accuracy， which clarifies the scientificity of the conclusions obtained from the tests. The results show that the main component content of ginkgo biloba extracts from the same region produced by different manufacturers is different. Multivariate statistical analysis can be used to interpret the components differences and their internal correlation， and it is believed that catechin， gallic acid， protocatechin acid and others are the main characteristic components reflecting the differences of small molecular organic acid content in ginkgo biloba extracts from different manufacturers.

Key words：Multivariate statistical analysis; Ginkgo biloba extracts; Small organic acids; Chromatographic column

0 引言

銀杏葉提取物的主要成分包含了銀杏黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯類成分等，其可以通過調(diào)節(jié)人體血脂等對人體血管進(jìn)行軟化、保護(hù)等。銀杏葉提取物不僅對心、腎、腦，血管具有保護(hù)作用，同時對4肢的血管也具有保護(hù)作用，并且可以改善某些患者的臨床癥狀。然而，銀杏葉的有效成分較為復(fù)雜，除提到的兩種有效成分外，據(jù)不同學(xué)者研究表明，其內(nèi)部成分至少有160多種有機(jī)酸、酚類物質(zhì)還可以發(fā)揮保健或藥用效果。因此，針對銀杏葉提取物進(jìn)行成分分析，始終是銀杏產(chǎn)業(yè)、醫(yī)療保健產(chǎn)業(yè)高度關(guān)注的研究方向。

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又稱高壓液相色譜，是一種以待檢測液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分離和分析的方法[3]。利用HPLC法測定液體成分，具有分離效能高、分離靈敏度高、分析速度快等優(yōu)勢。因此，本文利用該法對銀杏葉提取物有效成分含量進(jìn)行分析，對銀杏葉提取物中的9種小分子有機(jī)酸含量進(jìn)行分析，通過不同品牌銀杏葉提取物對比得出銀杏葉提取物較為理想的配伍方式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料與設(shè)備

本文進(jìn)行銀杏葉提取物成分含量分析，主要目的是確定不同品牌銀杏葉提取物中各小分子有機(jī)酸成分含量[4-5];采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）主要依賴高效液相色譜儀實(shí)現(xiàn)，該儀器通常包含四元泵溶劑系統(tǒng)、自動進(jìn)樣器等設(shè)備。此外，本文在試驗中，還需要依賴超聲波清洗劑、超純水儀等設(shè)備，對提取物進(jìn)行除污以及提供優(yōu)質(zhì)水環(huán)境等。

銀杏葉提取物中的9種小分子有機(jī)酸主要指的是：①兒茶素（C15H14O6H2O），又名兒茶酸可以防治心血管疾病、預(yù)防癌癥等;②沒食子酸[C6H2（OH）3COOH]，屬于有機(jī)酸，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等功能;③原兒茶酸[（HO）2C6H3COOH]，又名3，4-二羥基苯甲酸，臨床用于治療慢性氣管炎具有一定的抗菌作用;④6-羥基犬尿喹啉酸亦稱犬尿喹啉酸，與白細(xì)胞跟內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的調(diào)控密切相關(guān);⑤莽草酸（C7H10O5），能夠有效抑制血小板聚積，對人體而言具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用;⑥表兒茶素（C15H14O6），是一種有效的抗氧化劑，同時也能夠有效清除人體自由基;⑦對羥基苯甲酸（C7H6O3），可抑制霉菌的生長;⑧對羥基肉桂酸（C9H8O3），有很強(qiáng)的生物活性，對人體而言就有抗氧化、抗腫瘤、抗化療升白等作用;⑨咖啡酸（C9H8O4），對人體有較明顯的抑菌和抗病毒活性作用[4-6]。本文將會選擇國內(nèi)外8家企業(yè)對外公開銷售的若干類銀杏葉提取物產(chǎn)品作為對照組，以本試驗自配的銀杏葉提取物為實(shí)驗組，重點(diǎn)針對銀杏葉提取物中這9種小分子有機(jī)酸含量進(jìn)行分析。

1.2 試驗過程

第1步，將購買的8家企業(yè)對外銷售的45批次銀杏葉提取物分別進(jìn)行命名，如表1所示;第2步，精密提取9種小分子有機(jī)酸并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液，制成混合物對照組;第3步，對提取物進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗等，得到初步試驗結(jié)果;第4步，對試驗樣品進(jìn)行直觀分析、聚類分析、主成分分析等，得到9種有機(jī)酸成分之間的相關(guān)性分析結(jié)果。

1.3 試驗方法

本試驗成功的關(guān)鍵在于對高效液相色譜儀、流動相梯度洗脫成分的控制。本文選擇了日本島津出產(chǎn)的GL Inertsil ODS-3色譜柱（色譜柱參數(shù)：250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行試驗分析;試驗中的流動相選擇不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙腈（C2H3N）溶液搭配質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的磷酸緩沖溶液;梯度洗脫時保持體積流量1 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣體積為10 μl。表2為梯度洗脫環(huán)節(jié)的參數(shù)設(shè)置情況，試驗開始至8 min時，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～6%的C2H3N溶液搭配質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的磷酸緩沖溶液進(jìn)行洗脫;在8～13 min時，以質(zhì)量濃度為6%的C2H3N溶液搭配質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的磷酸緩沖溶液進(jìn)行洗脫;以此類推，最終得到不同洗脫梯度狀態(tài)下的色譜柱數(shù)據(jù)。

本試驗成功的關(guān)鍵在于對高效液相色譜儀、流動相梯度洗脫成分的控制，表2所示為高效液相色譜儀以及梯度洗脫等環(huán)節(jié)的參數(shù)控制。

1.3.1 線性關(guān)系考查

通過精準(zhǔn)配備相關(guān)混合溶液按照表2所示的參數(shù)控制情況進(jìn)行色譜條件測定，以本文自制的對照組溶液質(zhì)量為 x 軸，以其中9種小分子有機(jī)酸在色譜柱中表現(xiàn)出的波峰面積為 y 軸，通過繪制銀杏葉提取物中待測成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到表3所示各成分的相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限等參數(shù)。

1.3.2 方法學(xué)考查

本文在方法學(xué)視角將會采用精密度實(shí)驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性實(shí)驗以及準(zhǔn)確度試驗，分別對試驗環(huán)境所用儀器、實(shí)驗樣品溶液穩(wěn)定性、實(shí)驗方法重復(fù)性以及實(shí)驗準(zhǔn)確度進(jìn)行驗證[7-9]。驗證結(jié)果表明，本文所采用的實(shí)驗儀器精密度、穩(wěn)定性良好，可以進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗。同時，幾種小分子有機(jī)酸的回收率基本均超過99%，具有較好的準(zhǔn)確度。

2 實(shí)驗結(jié)果與分析

2.1 樣品直觀分析

取表1中45批次樣品各1份，進(jìn)行高效液相色譜儀分析，按照表2的參數(shù)控制情況分別測定各樣品中9種小分子有機(jī)酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到45種樣品中有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具體結(jié)果如表4所示。

從表4的結(jié)果來看，8個廠家所生產(chǎn)的45批次銀杏葉提取物產(chǎn)品中9種小分子有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)值并不相同，D廠家所生產(chǎn)的銀杏葉提取物9種小分子有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高;而H廠家所生產(chǎn)的銀杏葉提取物9種小分子有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，且差距超過21 mg/g。但是，這種總成分分析法并不能明確得到試樣中各有機(jī)酸之間的質(zhì)量差異情況，還需要對各試樣進(jìn)行主成分分析等過程。此外，利用SPSS22.0對45份溶液進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類分析結(jié)果顯示，只有D廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品可以單獨(dú)聚為一類，其他廠家的各類型產(chǎn)品均可聚為一類?？梢姡珼廠家在生產(chǎn)銀杏葉提取物產(chǎn)品時所采用的配方明顯與其他廠家之間存在較大的差異。但造成差異的具體原因還需要進(jìn)行詳細(xì)的分析。

2.2 主成分分析

再次利用SPSS 22.0對45份溶液進(jìn)行主成分分析。主成分分析是在盡可能保持原有數(shù)據(jù)信息的前提下，通過n次分析和降維處理，對海量數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行簡化處理方法。本文在對45份溶液進(jìn)行6次主成分分析以后得到表5所示樣本中主要成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率。

由表5的主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率分析得到了6組試驗結(jié)果，但若針對6組數(shù)據(jù)進(jìn)行載荷因子篩選，還是要進(jìn)行大量的計算。為此，仍然需要將6組試驗結(jié)果進(jìn)行簡化。根據(jù)方差貢獻(xiàn)率取樣理論要求，只要主成分方差貢獻(xiàn)率大于等于85%，即可認(rèn)為該次主成分分析具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，本試驗認(rèn)為選擇前兩次主成分分析結(jié)果即可表征全部樣品信息。將表5前兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行載荷因子篩選，得到旋轉(zhuǎn)變換以后的因子矩陣，具體結(jié)果如表6所示。

由表6可知，以上9種小分子有機(jī)酸載荷因子旋轉(zhuǎn)變換以后，只有兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸以及6-羥基犬尿喹啉酸在第1次主成分因子分析上表現(xiàn)出明顯的高載荷特征（載荷絕對值>0.9）;而在第2次主成分分析中，所有有機(jī)酸均沒有表現(xiàn)出明顯的高載荷特征。因此，本文主要參考第1次主成分因子分析結(jié)果，該結(jié)果表明兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸以及6-羥基犬尿喹啉酸這4種有機(jī)酸是不同溶液樣品內(nèi)部成分質(zhì)量差異的主要特征成分;換言之，這4項指標(biāo)是最能夠直接體現(xiàn)不同品牌銀杏葉溶液中有機(jī)酸含量差異的4項指標(biāo)。可見，只有這4種元素能夠明顯影響8個廠家45批次銀杏葉提取物質(zhì)量差異，且這4種化合物之間具有密切的相互聯(lián)系。

對表6中第1次主成分分析數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗，篩選出8種有機(jī)酸之間的相關(guān)性，從而探討不同有機(jī)酸成分之間的內(nèi)在聯(lián)系，揭示銀杏葉提取溶液趨于共性的有機(jī)酸組成信息特征。檢驗結(jié)果顯示，兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸以及6-羥基犬尿喹啉酸這4種有機(jī)酸之間具有顯著的正相關(guān)性，表明這4種有機(jī)酸的含量之間存在明顯的密切關(guān)系，基本上某一種酸含量的提升都能表明另外3種酸含量的同步提升。

2.3 回收率實(shí)驗

加樣回收實(shí)驗取本品已知的含量、同一批號樣品的幾種，精密稱定，置100 ml量瓶中，分成兩組加入對照品溶液適量，分別按供試品溶液制備方法制得兩種供試品溶液，按含量測定方法進(jìn)行實(shí)驗，計算回收率，變異系數(shù)均小于3%。結(jié)果表明。本試驗方法回收率較高，此方法可行。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

銀杏葉片用于瘀血阻絡(luò)引起的胸痹心痛、中風(fēng)、半身不遂、舌強(qiáng)語謇;以及冠心病、穩(wěn)定型心絞痛、腦梗死具有上述證候者[10]。本文針對市面上8個廠家共計45批次的銀杏葉提取物有機(jī)酸含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：D廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品在配方方面具有明顯區(qū)別于其他廠家的特征，其9種小分子有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)超其他7個廠家。通過主成分分析表明：兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸以及6-羥基犬尿喹啉酸這4種有機(jī)酸能夠影響銀杏葉溶液中酸類總量的4項指標(biāo)因素。因此，本文認(rèn)為造成不同廠家有機(jī)酸含量差異的直接原因，是D廠家兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸以及6-羥基犬尿喹啉酸這4種有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯超過其他7個廠家所致。

3.2 討論

首先，兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸以及6-羥基犬尿喹啉酸4種有機(jī)酸是影響銀杏葉提取物有效成分的主要因素，廠家在生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品時應(yīng)格外強(qiáng)調(diào)這4類物質(zhì)的配比以及內(nèi)部相關(guān)關(guān)系，根據(jù)產(chǎn)品的不同功效酌情調(diào)整產(chǎn)品配比;其次，本文采用HPLC法測量銀杏葉提取物中9種小分子有機(jī)酸含量，能夠從直觀（總含量分析）和微觀（主成分分析）兩個視角對提取物進(jìn)行成分分析，得到的結(jié)果具有直觀、高效的效果。且能夠利用SPSS22.0得到不同有機(jī)酸之間的線性關(guān)系，能夠為廠家生產(chǎn)同類型產(chǎn)品提供借鑒。

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