基于廣靶代謝組學(xué)分析馬齒莧根莖葉中5類重要初生代謝產(chǎn)物

張少平 李洲 練冬梅 姚運(yùn)法 賴正鋒 吳松海 洪建基

摘要：為了解馬齒莧中重要初生代謝產(chǎn)物成分及其在不同部位相對(duì)含量及聯(lián)系，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行廣靶代謝組學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)在馬齒莧中檢測(cè)到脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、糖及醇類、維生素等5類重要初生代謝產(chǎn)物分別含化合物69、59、36、21、8種;聚類熱圖分析表明，在馬齒莧根莖葉中，脂質(zhì)和氨基酸及其衍生物總體含量較高，有機(jī)酸含量次之，糖及醇、維生素含量較低;脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物和維生素在葉部總體含量較高，有機(jī)酸在莖部總體含量較高，糖及醇在根莖葉部含量無明顯差異。5類次生代謝產(chǎn)物所含的193種化合物在馬齒莧根莖葉部的含量具有明顯差異。

關(guān)鍵詞：馬齒莧;廣靶代謝組學(xué);初生代謝產(chǎn)物;化合物;成分分析

中圖分類號(hào)： S567.21+9.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0139-08

收稿日期：2021-03-25

基金項(xiàng)目：福建省科技廳計(jì)劃（編號(hào)：2020R1030001）。

作者簡(jiǎn)介：張少平（1975—），男，江西撫州人，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事特色蔬菜相關(guān)研究。E-mail：zspnc@163.com。

通信作者：吳松海，副研究員，主要從事特色蔬菜研究，E-mail：7789446@qq.com;洪建基，研究員，主要從事特色蔬菜研究，E-mail：76227508@qq.com。

脂類、糖類、蛋白質(zhì)等大分子的合成分解與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，也是所有植物細(xì)胞最基本的共性代謝過程，稱為初生代謝，初生代謝過程形成的化合物稱為初生代謝產(chǎn)物[1]。馬齒莧（Portulaca oleracea L.）是一種重要的藥食同源植物，具有較高的藥用價(jià)值，廣泛分布于我國(guó)熱帶、亞熱帶以及世界其他地區(qū)[2-3]。馬齒莧所含的多糖[4]、脂肪酸[5]、氨基酸[6]、維生素[7]、有機(jī)酸[8]等重要初生代謝產(chǎn)物，具有降血糖血脂、抗氧化、抗炎、抗癌、改善記憶、增強(qiáng)免疫力等作用[9-11]。

馬齒莧所含化合物種類豐富，相關(guān)成分分析測(cè)定及提取等研究報(bào)道較多[12-13]，而隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，該技術(shù)運(yùn)用于馬齒莧相關(guān)成分檢測(cè)研究將更全面和準(zhǔn)確[14-15]。本研究以福建省閩南地區(qū)常見的馬齒莧野生種為研究對(duì)象，通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）對(duì)其根莖葉廣靶代謝組進(jìn)行分析，系統(tǒng)獲取馬齒莧中脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、糖及醇類、維生素等5類重要的初生代謝產(chǎn)物的具體成分和相對(duì)含量，以期為進(jìn)一步進(jìn)行馬齒莧功效成分提取利用等打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬齒莧為福建省閩南地區(qū)野生種，筆者于2020年7月12日馬齒莧長(zhǎng)勢(shì)旺盛時(shí)期，從福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所特色蔬菜種質(zhì)資源圃采取紅莖、綠葉和白根的馬齒莧資源，取根、莖、葉各3份（共計(jì)9份），每份60 g左右，用75%乙醇洗凈晾干，裝入封口袋標(biāo)記后保存至-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 廣靶代謝組樣品提取 從-80 ℃冰箱取出馬齒莧所測(cè)樣品，放入凍干機(jī)中干燥;干燥后的試驗(yàn)材料在30 Hz頻率下的研磨儀中進(jìn)行研磨約 1.5 min;稱取每個(gè)待測(cè)樣品粉末100 mg用0.6 mL 70%的甲醇提取液溶解;相關(guān)溶解液置于4 ℃冰箱約10 h，期間渦旋6次以提高得率;經(jīng)10 000 g轉(zhuǎn)速離心10 min后取上清液，使用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液后存儲(chǔ)于進(jìn)樣瓶中，測(cè)試分析備用。

1.2.2 超高效液相色譜采集條件 所用色譜柱內(nèi)部填充物粒徑為1.8 μm，內(nèi)徑×長(zhǎng)度=2.1 mm×100 mm，流動(dòng)相A相為超純水加入0.04%乙酸;流動(dòng)相B相為乙腈中加入0.04%乙酸。洗脫梯度B相比例5%→95%，時(shí)間0～10 min;B相比例95%，維持10～11 min;B相比例95%→5%，時(shí)間11～11.1 min;B相比例降為5% 平衡至14 min。流速 0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為4 μL。

1.2.3 串聯(lián)質(zhì)譜采集條件 串聯(lián)質(zhì)譜中電噴霧離子源溫度為550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣 206.85 kPa，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential，簡(jiǎn)稱DP）和碰撞能（collision energy，簡(jiǎn)稱CE）進(jìn)行掃描檢測(cè)[16]。

1.2.4 廣靶代謝物定性與定量 根據(jù)北京百邁客生物科技有限公司所建數(shù)據(jù)庫（metware database），通過二級(jí)譜信息，分析時(shí)去除陽離子和碎片離子重復(fù)信號(hào)。利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行代謝產(chǎn)物定量。獲取馬齒莧根、莖、葉各3個(gè)樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)，再對(duì)所有物質(zhì)質(zhì)譜峰峰面積積分，同時(shí)對(duì)同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧5類初生代謝產(chǎn)物分析

在馬齒莧根、莖、葉各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)共9個(gè)樣品中，共檢測(cè)出5類重要初生代謝產(chǎn)物：脂質(zhì)69種、氨基酸及其衍生物59種、有機(jī)酸36種、糖及醇類21種、維生素8種，共193種化合物。

進(jìn)一步對(duì)5類初生代謝產(chǎn)物在馬齒莧根莖葉中相對(duì)含量進(jìn)行聚類熱分析（圖1）可知，馬齒莧所含脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物較高，有機(jī)酸含量次之，糖及醇類、維生素含量較低。比較5種初生代謝產(chǎn)物在馬齒莧根莖葉中相對(duì)含量可知，脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物和維生素在葉部含量較高，有機(jī)酸在莖部含量較高，糖、醇類在根莖葉部含量無明顯差異。

2.2 69種脂質(zhì)分析

由表1可見，69種脂質(zhì)分為6個(gè)亞類：甘油酯、磷脂酰膽堿、鞘脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、游離脂肪酸，其化合物分別有11、3、3、16、6、30種。

在甘油酯中，單酰甘油酯（酰基18：3）異構(gòu)3在葉部含量較高，單酰甘油酯（?；?8：4）異構(gòu)1在根部含量極低。鞘脂中，十六烷基鞘氨醇在根莖葉部含量均較高，4-羥基鞘氨醇在莖部含量較高，D-赤式-二氫鞘氨醇在葉部含量極低。溶血磷脂酰膽堿中，溶血磷脂酰膽堿（16：0）和溶血磷脂酰膽堿（16：1）在根莖葉部含量均較高，溶血磷脂酰膽堿（16：0） （2n異構(gòu)）、 溶血磷脂酰膽堿（16：2）和溶血磷脂酰膽堿（18：1）在葉部含量較高。溶血磷脂酰乙醇胺中，溶血磷脂酰乙醇胺（18：1） 和溶血磷脂酰乙醇胺（18：1）（2n異構(gòu)） 在葉部含量較高。游離脂肪酸中，硬脂酸在根莖葉中含量均較高，γ-亞麻酸在莖葉中含量較高，反油酸在根葉中含量較高，肉豆蔻酸根莖中含量較高，12，13-環(huán)氧十八碳二烯酸在莖葉中含量極低，2，3-二羥基丙基-9，12-十八碳二酸酯-己糖在葉中含量極低，10，16-二羥基棕櫚酸在根部含量極低。

2.3 59種氨基酸及其衍生物分析

在59種氨基酸及其衍生物中（表2），反-4-羥基-L-脯氨酸、D-纈氨酸、D-苯丙氨酸和酪胺在根莖葉部相對(duì)含量均較高;L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-正亮氨酸在莖葉部相對(duì)含量均較高;L-谷氨酸、DL-谷氨酸、DL-脯氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸和DL-正纈氨酸在葉部含量較高。而N-丙酰甘氨酸在葉部含量極低，4-羥基-L-谷氨酸在莖部含量極低，N-α-乙酰-L-精氨酸在根部含量極低。

2.4 36種有機(jī)酸分析

在36種有機(jī)酸中（表3），蘋果酸在葉和莖中含量較高，奎尼酸和檸檬酸在莖中含量較高;而草酰乙酸、D-木糖酸和延胡索酸在莖部含量極低，2-甲基丁二酸和3-甲基-2-氧代-丁酸在根部含量極低。

2.5 21種糖、醇類分析

馬齒莧所含21種糖、醇類中（表4），葡萄糖-1-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸在馬齒莧根莖葉部含量均較高;磷酸葡糖酸和肌醇半乳糖苷在葉部含量較高;而D-松三糖和木糖醇在葉部含量極低，松二糖在莖部含量極低。

2.6 8種維生素

馬齒莧所含8種維生素中（表5），煙酰胺和 D-泛酸在馬齒莧根莖葉部含量均較高;維生素C在葉和莖部含量較高;而吡哆醇O-阿魏酰己糖苷在莖部含量極低。

3 討論

馬齒莧作為重要的藥食同源植物，其成分分析研究報(bào)道較多[17-18]，然而相關(guān)研究由于所用技術(shù)手段和方法等限制，導(dǎo)致研究不夠系統(tǒng)，所測(cè)成分也不夠全面[19-20]。代謝組學(xué)是采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)植物所有低分子量代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門新型學(xué)科。

本研究通過靶向代謝組學(xué)進(jìn)行馬齒莧5種重要初生代謝產(chǎn)物分析，首次系統(tǒng)獲取該馬齒莧中69種脂質(zhì)、59種氨基酸及其衍生物、36種有機(jī)酸、21種糖、醇類以及8種維生素。同時(shí)，本研究首次發(fā)現(xiàn)馬齒莧中脂質(zhì)和氨基酸及其衍生物含量較高、有機(jī)酸含量次之、糖、醇類以及維生素含量較低;同時(shí)，脂質(zhì)、氨基酸及其衍生物和維生素在馬齒莧葉部含量較高，有機(jī)酸在莖部含量較高，糖、醇類在根莖葉部含量差異不明顯;但5類次生代謝產(chǎn)物中所含193種具體化合物在馬齒莧根莖葉部的具體含量差異明顯。因此本研究同時(shí)詳細(xì)列舉了所有化合物在馬齒莧根莖葉中相對(duì)含量，為進(jìn)一步從事馬齒莧中具體成分的提取利用及功效評(píng)價(jià)等提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]余龍江，趙春芳. 次生代謝產(chǎn)物生物合成——原理與應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2017：2

[2] Khazdair M R，Anaeigoudari A，Kianmehr M.anti-asthmatic effects of portulaca oleraceaand its constituents，a review[J]. Journal of Pharmacopuncture，2019，22（3）：122-130.

[3]Zhou Y X，Xin H L，Rahman K，et al. Portulaca oleracea L.：a review of phytochemistry and pharmacological effects[J]. BioMed Research International，.2015，2015：925631.

[4]寧 娜，韓建軍，郁建生，等. 馬齒莧多糖提取工藝研究進(jìn)展[J]. 山東化工，2020，49（18）：67-67.

[5]李冠文，秦 楠，郭麗麗，等. 馬齒莧多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2020，11（14）：4549-4555.

[6]李 榮，王 偉，付鳳富，等. 毛細(xì)管電泳法測(cè)定馬齒莧中氨基酸的含量[J]. 分析化學(xué)，2009，37（1）：134-134.

[7]Szalai G，Dai N，Danin A，et al.Effect of nitrogen source in the fertilizing solution on nutritional quality of three members of the Portulaca oleracea aggregate[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90（12）：2039-2045.

[8]Javed M，Akram M S，Habib N，et al. Deciphering the growth，organic acid exudations，and ionic homeostasis of Amaranthus viridis L. and Portulaca oleracea L. under lead chloride stress[J]. Environmental Science and Pollution Research t，2018，25（3）：2958-2971.

[9]Rahimi V，Ajam F，Rakhshandeh H. A pharmacological review on Portulaca oleracea L.：focusing on anti-inflammatory，anti-oxidant，immuno-modulatory and antitumor activities [J]. Journal of Pharmacopuncture，2019，22（1）：7-15.

[10]Farkhondeh T，Samarghandian S，Azimi-Nezhad M，et al.The Hepato-protective effects of Portulaca olerace L. extract：review[J]. Current Drug Discovery Technologies，2019，16（2）：122-126.

[11]Rahimi V B，Ajam F，Rakhshandeh H，et al.A pharmacological review on Portulaca oleraceaL.：focusing on anti-inflammatory，anti-oxidant，immuno-modulatory and antitumor activities[J]. Journal of Pharmacopuncture，2019，22（1）：7-15.

[12]Shanker N，Debnath S. Impact of purslane （Portulaca oleracea L.） leaves extract to enhance the anti-oxidant potential of edible oils during heating[J]. Journal of Oleo Science，2019，68（4）：321-328.

[13]劉佃雨. 馬齒莧化學(xué)成分、質(zhì)量控制及多酚提取物制備工藝研究[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2011：7-15.

[14]Mulcahy S，Googacre C. Opening Pandora’s box of academic integrity：using plagiarism detection software [R]//Atkinson R，McBeath C，Jonas-Dwyer D，et al. Beyond the comfort zone：proceedings of the 21st ASCILITE Conference. Perth，2004：688-696.

[15]董 靜，邢錦城，洪立洲，等. 干燥工藝對(duì)馬齒莧活性成分及風(fēng)味物質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（16）：179-183.

[16]Chen W，Gong L，Guo Z L，et al.A novel integrated method for large-scale detection，identification，and quantification of widely targeted metabolites：application in the study of rice metabolomics[J]. Molecular Plant，2013，6（6）：1769-1780.

[17]Park J E，Seo Y，Han J S.hm-chromanone isolated from Portulaca oleracea Ⅰ. Protects ins-1 pancreatic β cells against glucotoxicity-induced apoptosis[J]. Nutrients，2019，11（2）：404.

[18]扈本荃，申亞麗，李金娟，等. HPLC法測(cè)定馬齒莧中3種有機(jī)酸含量[J]. 中藥材，2015，378（8）：1677-1679.

[19]Elshamy M M，Heika Y M，Bonanomi G. Phytoremediation efficiency of Portulaca oleracea L. naturally growing in some industrial sites，Dakahlia District，Egypt[J]. Chemosphere，2019，225（1）：678-687.

[20]Park J E，Lee J S，Lee H A，et al. Portulaca oleracea L. extract enhances glucose uptake by stimulating glut4 translocation to the plasma membrane in 3T3-L1 adipocytes[J]. Journal of Medicinal Food，2018，21（5）：462-468.