綠針假單胞菌YL-1高產(chǎn)熒光性嗜鐵素的搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化

余文杰 喬俊卿 易厚天 左楊 劉永鋒 劉郵洲

摘要：綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）YL-1是一種對多種病原菌均有良好防治效果的生防菌株，前期研究結(jié)果表明，在室內(nèi)缺鐵培養(yǎng)基和自然環(huán)境中，綠針假單胞菌的主要抑菌物質(zhì)是其分泌的熒光性嗜鐵素（Pyoverdine，簡稱PVD）。為提高其嗜鐵素的產(chǎn)量，采用搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵，通過 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、中心組合（CCD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法，優(yōu)化YL-1菌株高產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，最終獲得YL-1菌株高產(chǎn)嗜鐵素的最佳培養(yǎng)基成分為1.52 g/L丁二酸、2.00 g/L丁二酸鈉、0.88 g/L MgSO4·7H2O、0.50 g/L （NH4）2SO4、0.50 g/L蔗糖、3.49 g/L KH2PO4，5.44 g/L K2HPO4，最佳培養(yǎng)條件：溫度為26 ℃，pH值為7.0，發(fā)酵時(shí)間為36 h，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL液體。搖瓶試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件后，菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量提高43.18%，D405 nm/D600 nm值為2.36，優(yōu)化效果明顯。

關(guān)鍵詞：綠針假單胞菌;熒光性嗜鐵素PVD;發(fā)酵培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;工藝優(yōu)化

中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0225-08

收稿日期：2021-04-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金 （編號：31672076）;蘇州市科技計(jì)劃 （編號：SNG2018095） 。

作者簡介：余文杰（1997—），男，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：260717453@qq.com。

通信作者：劉郵洲，博士，研究員，主要從事植物病害生物防治與農(nóng)藥開發(fā)研究。E-mail：shitouren88888@163.com。

鐵是一種地殼中廣泛存在的微量元素，同時(shí)也是許多生物體維持正常生命活動所必需的，但由于鐵元素的特性導(dǎo)致自然環(huán)境中可以使用的自由鐵濃度遠(yuǎn)低于大部分微生物的生理需求[1]。為吸收土壤中的鐵元素以滿足自身需求，生物體需要形成一套高效的鐵吸收機(jī)制來維持自身生命活動，包括還原機(jī)制、螯合機(jī)制以及質(zhì)子化機(jī)制，其中，利用嗜鐵素（siderophore，別稱鐵載體）來運(yùn)轉(zhuǎn)外界鐵離子是生物體較為重要的一種螯合機(jī)制[2]。

假單胞菌（Pseudomonas spp.）是一種常見的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，可以抑制多種植物病原菌的生長[3]。假單胞菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，已報(bào)道的主要是吩嗪類 （Phenazine，簡稱PHZ）、硝吡咯菌素 （Pyrrolnitrin，簡稱PRN）、藤黃綠膿菌素 （Pyoluteorin，簡稱PLT）、氫氰酸（HCN）和熒光性嗜鐵素（Pyoverdine，簡稱PVD）等[4-5]。PVD作為一種鐵螯合劑，可以螯合周圍環(huán)境中的鐵離子，使病原菌無法獲得生長所必需的鐵營養(yǎng)，生長發(fā)育受到抑制[6]。Chen等發(fā)現(xiàn)，臺灣假單胞菌（P. taiwanensis）可以產(chǎn)生PVD，對水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）生長有抑制作用[7];Chlebek 等發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)嗜鐵素的熒光假單胞菌（P. fluorescens）BRZ63對多種病原真菌均有抑制作用[8];Ran等從馬鈴薯根際中分離出生防細(xì)菌-惡臭假單胞桿菌（P. putida）WCS358r菌株，該菌株產(chǎn)生的嗜鐵素可以抑制桉樹灰霉病的發(fā)生[9]。假單胞菌分泌的PVD的基本結(jié)構(gòu)由二羥基喹啉集團(tuán)、1條肽鏈、1條脂肪酸側(cè)鏈組成，在自然光下呈黃綠色，紫外光激發(fā)時(shí)可以發(fā)生熒光反應(yīng)，這一特性是其種屬所特有的[10]。

綠針假單胞菌（P. chlororaphis）YL-1是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從大豆根圍分離獲得的一株對多種病原菌均有良好抑制作用的生防菌[11]。前期研究結(jié)果表明，在室內(nèi)缺鐵培養(yǎng)基和自然環(huán)境中，菌株 YL-1 分泌的PVD具有明顯的抑菌作用，且結(jié)構(gòu)新穎[10]。本研究首先比較8種常見嗜鐵素發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響，篩選出最佳的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過Plackett-Burman試驗(yàn)、中心組合（central composite design，簡稱CCD）試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法對菌株YL-1基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化;同時(shí)，采用單因素篩選的方法，探明菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的最佳培養(yǎng)條件，旨在為菌株YL-1的田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

綠針假單胞菌YL-1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害與生物防治研究室保存。

8種常見培養(yǎng)基及配方：（1）1/2胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基：15.00 g胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，1 000 mL蒸餾水;（2）LB培養(yǎng)基：10.00 g胰蛋白胨、5.00 g酵母提取物、10.00 g NaCl、1 000 mL蒸餾水;（3）SM培養(yǎng)基：3.00 g KH2PO4、6.00 g K2HPO4、0.10 g MgSO4·7H2O、1.00 g （NH4）2SO4、4.00 g丁二酸、1 000 mL蒸餾水，pH值為7.0;（4）Iron-limited medium：12.80 g Na3PO4·7H2O、3.00 g KH2PO4、0.50 g NaCl、1.00 g NH4Cl、0.50 g MgSO4·7H2O、21.90 mg CaCl2、4.00 g葡萄糖、10.00 g酸水解酪蛋白、5 mL丙三醇、1 000 mL蒸餾水;（5）Succinate medium：3.00 g KH2PO4、6.00 g K2HPO4、0.10 g MgSO4·7H2O、1.00 g （NH4）2SO4、4.00 g丁二酸鈉、1 000 mL蒸餾水、pH值為7.0;（6）金氏培養(yǎng)基甲：20.00 g蛋白胨、1.40 g MgCl2、10.00 g K2SO4、10 mL 丙三醇、1 000 mL蒸餾水;（7）金氏培養(yǎng)基乙：20.00 g蛋白胨、1.50 g K2HPO4、1.50 g MgSO4·7H2O、10 mL丙三醇、1 000 mL蒸餾水;（8）WW[12]培養(yǎng)基：1.50 g丙三醇、1.00 g酸水解酪蛋白、2.50 g MgSO4·7H2O、2.50 g K2HPO4、1 000 mL 蒸餾水、pH值為6.5。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑包括CuSO4、NH4Cl、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O均購自西隴化工股份有限公司;瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;丁二酸、K2HPO4、（NH4）2SO4均購自上海麥克林生化科技有限公司;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術(shù)有限公司;K2SO4、MgCl2、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、甘油、葡萄糖、丙三醇均購自西隴化工股份有限公司;蔗糖、酸水解酪蛋白、蛋白胨、Na3PO4·7H2O、CaCl2、MnSO4均購自上海麥克林生化科技有限公司。

主要儀器包括電子天平（JM-A6002 余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）、離心機(jī)（Eppendorf AG Germany）、分光光度計(jì)（UVmini-1240 SHIMADZU）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-240 上海智城分析儀器制造有限公司）、光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌器（LDZF-50L-Ⅱ 上海申安醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺（SW-CJ-1CU 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、微量移液槍（德國Eppendorf公司）、pH值儀[Starter 2100奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.3 發(fā)酵種子液的制備

試驗(yàn)于2021年1月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。首先取-70 ℃冰箱保存的 YL-1 菌種于LB平板活化，28 ℃倒置培養(yǎng)，待平板上長出單菌落后，挑取單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，待培養(yǎng)液D600 nm≈1.0，即為發(fā)酵種子液。

1.4 培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量的測定

參照文獻(xiàn)[12]測定嗜鐵素產(chǎn)量，將發(fā)酵種子液以1 ∶100比例轉(zhuǎn)接至100 mL培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 搖菌培養(yǎng)48 h。取2 mL菌液于2 mL EP管中，6 000 r/min離心10 min，分離上清液和菌體。將上清液移入新的2 mL EP管中，菌體用2 mL PBS緩沖液充分懸浮。以無菌培養(yǎng)基為對照，測其上清液D405 nm值;以PBS緩沖液為對照，測其菌體D600 nm值。計(jì)算D405 nm/D600 nm值，即為嗜鐵素的相對產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)

1.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

比較菌株YL-1在8種常見培養(yǎng)基中的D405 nm/D600 nm值，篩選最佳的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選

根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選結(jié)果可知，菌株YL-1在SM培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量最高，以SM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同碳源、氮源、金屬離子以及鹽離子對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.2.1 碳源對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變其他成分，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丁二酸鈉、蔗糖、甘油、葡萄糖;同時(shí)，將丁二酸替換為丁二酸鈉、蔗糖、甘油、葡萄糖、嗜鐵素產(chǎn)量測定同“1.4”節(jié)，觀察碳源的增加或改變對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.2.2 氮源對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變其他成分，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入酸水解酪蛋白、蛋白胨;同時(shí)將（NH4）2SO4替換為酸水解酪蛋白、蛋白胨，嗜鐵素產(chǎn)量測定同“1.4”節(jié)，觀察氮源的增加或改變對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.2.3 金屬離子及鹽離子對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變其他成分，向培養(yǎng)基中加入一定濃度的CaCl2、CuSO4、MnSO4、NaCl，嗜鐵素產(chǎn)量測定同“1.4”節(jié)，觀察金屬離子以及鹽離子的加入對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.3 Plackett-Burman試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)

選取單因素篩選試驗(yàn)對嗜鐵素產(chǎn)量有較大提高作用的影響因子，采用Design Expert 10軟件設(shè)計(jì)PB搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)中每個(gè)因子設(shè)計(jì)高低2個(gè)水平，觀察其對嗜鐵素產(chǎn)生是否有顯著影響，試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對嗜鐵素產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)基關(guān)鍵成分并采用最陡爬坡試驗(yàn)確定關(guān)鍵因素的用量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 中心組合試驗(yàn)

在PB、最陡爬坡試驗(yàn)后，采用中心組合（CCD）試驗(yàn)對培養(yǎng)基關(guān)鍵成分進(jìn)行響應(yīng)曲面法優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 培養(yǎng)條件篩選

1.6.1 溫度對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種1%種子液，分別在24.0、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、30.0、32.0、34.0 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 pH值對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值分別設(shè)定為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，共計(jì)6個(gè)處理，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種1%種子液，在26 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 發(fā)酵時(shí)間對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中接種1%種子液，26 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)，取不同時(shí)間段的發(fā)酵液測定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.4 接種量對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的 250 mL 三角瓶中接種比例分別設(shè)定為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，共計(jì)5個(gè)處理，26 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h后測定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.5 轉(zhuǎn)速對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種2%種子液，轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為140、160、180、200 r/min，共計(jì)4個(gè)處理，26 ℃培養(yǎng)36 h后測定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.6 裝液量對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，分別在含50、75、100、125、150 mL 培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種2%種子液，26 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h后測定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

根據(jù)CCD試驗(yàn)結(jié)果以及培養(yǎng)條件篩選結(jié)果，配制優(yōu)化后的培養(yǎng)基，運(yùn)用新的培養(yǎng)條件，與原始培養(yǎng)基進(jìn)行比較，驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

Plackett-Burman試驗(yàn)、中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)曲面試驗(yàn)均利用Design Expert 10軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

由圖1可知，在8種培養(yǎng)基中，菌株YL-1在SM液體培養(yǎng)基中D405 nm/D600 nm值最高，達(dá)到1.61;其次是WW培養(yǎng)基，D405 nm/D600 nm值為1.08;菌株YL-1在金氏培養(yǎng)基甲、LB和1/2 TSA液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的嗜鐵素較少，D405 nm/D600 nm值分別為0.23、0.21、0.18。試驗(yàn)結(jié)果說明，在8種常見培養(yǎng)基中，SM培養(yǎng)基最適合菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選

2.2.1 碳源對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響

由圖2可知，單一碳源時(shí)，菌株YL-1在以丁二酸為碳源的SM液體培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量最高，D405 nm/D600 nm值為1.61，其他碳源替換處理情況下，D405 nm/D600 nm值均明顯下降;如果維持培養(yǎng)液中丁二酸成分不變，向其中加入丁二酸鈉，D405 nm/D600 nm值為2.13，嗜鐵素的產(chǎn)量提高32.29%，加入蔗糖時(shí)，D405 nm/D600 nm比值為1.64，嗜鐵素產(chǎn)量也略有提升。因此，接下來的研究將以丁二酸、丁二酸鈉、蔗糖為碳源進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.2 氮源對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響

由圖3可知，（NH4）2SO4為菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的最佳氮源，D405 nm/D600 nm值為1.61。當(dāng)?shù)刺鎿Q為酸水解酪蛋白時(shí)，D405 nm/D600 nm值為0.84，氮源替換為蛋白胨時(shí)，D405 nm/D600 nm值僅為0.48。此外，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增加氮源會降低菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量。因此，將以（NH4）2SO4為氮源進(jìn)行使用量的優(yōu)化。

2.2.3 金屬離子及鹽離子對菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響

由圖4可知，SM培養(yǎng)基中加入金屬離子及鹽離子反而降低了菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量，如在SM培養(yǎng)基中加入NaCl時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.55，加入MnSO4時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.46，加入CuSO4時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.41，加入CaCl2時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.21。據(jù)此說明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不需要再額外添加金屬離子及鹽離子。

2.3 PB試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)

由表1可知，KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、丁二酸這4個(gè)因子對嗜鐵素的產(chǎn)量有顯著影響（P<0.05）。隨后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)來確定關(guān)鍵因子的最佳用量，當(dāng)丁二酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4的用量分別為3.00、2.00、3.00、5.00 g/L時(shí)，培養(yǎng)液D405 nm/D600 nm值達(dá)到爬坡試驗(yàn)的最高值2.23。

2.4 CCD試驗(yàn)以及相應(yīng)曲面分析

在基于PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素5水平的CCD試驗(yàn)來確定各因素的最佳用量，對培養(yǎng)基成分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重回歸分析后，得出產(chǎn)物產(chǎn)率的二次多項(xiàng)方程式：Y=-5.571 27+2.227 71X1+1.350 63X2+0.417 39X3+1.610 56X4+0.059 861X1X2-0.235 19X1X3 -0.323 44X1X4-0.174 03X2X3-0.044 028X2X4+0.158 81X3X4-0.117 55X21-0.452 11X22-0.0703 02X23-0.132 93X24，校正系數(shù)R2=0.974 9。

式中：Y是嗜鐵素產(chǎn)量的預(yù)測值;X1、X2、X3、X4分別是丁二酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4。方差分析結(jié)果見表2。試驗(yàn)中變異系數(shù)（CV）為9.14%（<10%），屬于弱變異，證明試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，表2中P、R2、F值都進(jìn)一步證明了模型對嗜鐵素產(chǎn)量預(yù)測的準(zhǔn)確性。

根據(jù)得到的二次多項(xiàng)方程式求得4個(gè)因素的最優(yōu)值，即丁二酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4的用量分別為1.52、0.88、3.49、5.44 g/L時(shí)，嗜鐵素產(chǎn)量預(yù)測能達(dá)到最大，預(yù)測D405 nm/D600 nm值為2.25。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.5.1 溫度和pH值對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

當(dāng)溫度處于25.5～26.5 ℃這一范圍內(nèi)時(shí)，嗜鐵素產(chǎn)量較高，其中溫度為26 ℃時(shí)，D405 nm/D600 nm值為2.39。當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的能力會迅速降低，32 ℃時(shí)，D405 nm/D600 nm值降低至1.56（圖5）。培養(yǎng)液pH值對菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響較大。由圖6可知，產(chǎn)嗜鐵素的最適pH值出現(xiàn)在6.6～7.4這一范圍內(nèi)，其中培養(yǎng)液pH值為7.0時(shí)，D405 nm/D600 nm值為2.23，pH值為6.6、7.4時(shí)，D405 nm/D600 nm值分別為1.70、1.42。據(jù)此，研究中培養(yǎng)溫度設(shè)定為26 ℃，pH值設(shè)定為7.0。

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間、接種量、轉(zhuǎn)速和裝液量對菌株 YL-1 產(chǎn)嗜鐵素的影響

菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而不斷提高，接種后12 h時(shí)，D405 nm/D600 nm值為0.65;24 h時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.25;36 h時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.68;48 h 時(shí)，D405 nm/D600 nm值達(dá)到1.69，與36 h相比，無顯著差異，因此選擇36 h為最佳發(fā)酵時(shí)間（圖7）。隨著接種量的提高，菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)接種量為2%時(shí)，嗜鐵素的產(chǎn)量最高，D405 nm/D600 nm值為2.30。當(dāng)接種量繼續(xù)上升后，菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的能力快速下降，當(dāng)接種量為4%時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.31。這可能是由于嗜鐵素的合成和菌株YL-1的生長處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)接種量增大時(shí)，菌株較多地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分供自身生長，從而影響了嗜鐵素的合成（圖8）。當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，嗜鐵素的產(chǎn)量最高，D405 nm/D600 nm值為2.05，其他過高或過低的3個(gè)轉(zhuǎn)速反而會影響菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的能力，當(dāng)轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.22，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.69（圖9）。當(dāng)在250 mL三角瓶中裝液50 mL時(shí)，菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的能力最高，D405 nm/D600 nm值為2.33。推測較少的裝液量提高了瓶中的氧含量，因此提高了菌株YL-1生長繁殖的速度，進(jìn)而增加了嗜鐵素的產(chǎn)量（圖10）。

2.6 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

菌株YL-1在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36 h、溫度為26 ℃、pH值為7.0、接種量為2%、轉(zhuǎn)速為180 r/min以及裝液量為50 mL（250 mL三角瓶中），D405 nm/D600 nm值為2.36（圖11），與模型預(yù)測值接近。與原始出發(fā)培養(yǎng)基（SM培養(yǎng)基）相比，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后菌株YL-1的嗜鐵素產(chǎn)量提升43.18%，肉眼觀察發(fā)酵液的顏色更加黃綠，紫外光下觀察發(fā)酵液的熒光反應(yīng)更加強(qiáng)烈（圖12）。

3 討論與結(jié)論

嗜鐵素是假單胞菌產(chǎn)生的重要抗菌物質(zhì)，通過螯合周圍環(huán)境中的鐵離子，形成不能為其他病原菌所利用的鐵-嗜鐵素復(fù)合物，從而起到抑制病原菌生長的作用。同時(shí)，嗜鐵素也有促進(jìn)植物生長的作用，武雯雯等發(fā)現(xiàn)，用嗜鐵素處理黑麥草種子后，種子發(fā)芽率提高150.92%，提升效果顯著[13]。Trapet等發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌C7R12分泌的嗜鐵素能促進(jìn)擬南芥的生長[14]。而在臨床醫(yī)學(xué)上，嗜鐵素作為一種鐵螯合劑，可以用來治療人體內(nèi)鐵過量而引發(fā)的疾病，如地中海貧血癥[15]。除此之外，越來越多的醫(yī)學(xué)研究人員對微生物的鐵吸收系統(tǒng)非常有興趣，由此引發(fā)藥物的“特洛伊木馬策略”，即利用鐵載體攝取機(jī)制，將藥物和鐵載體偶聯(lián)，使藥物更容易進(jìn)入靶向病原微生物，同時(shí)還不會產(chǎn)生抗藥性[16-17]。因此，開發(fā)利用高產(chǎn)嗜鐵素的生防菌、提高嗜鐵素產(chǎn)量均具有重要意義。

有關(guān)嗜鐵素發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件篩選的研究，目前已有多篇報(bào)道，如伊艷杰等研究了熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件[18]，梁建根等對惡臭假單孢菌（P. putida）HZ-2產(chǎn)生嗜鐵素的發(fā)酵培養(yǎng)基及條件進(jìn)行了篩選[19]。但這些報(bào)道大多只使用單因素篩選的方法來考察嗜鐵素發(fā)酵條件，而且對培養(yǎng)基成分未做優(yōu)化。近年來，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和中心組合試驗(yàn)被廣泛運(yùn)用于微生物發(fā)酵工藝的篩選和優(yōu)化[20]。許睿娉利用Plackett-Burman試驗(yàn)得到了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HG-15菌株發(fā)酵最佳培養(yǎng)基，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液菌體數(shù)量提高2.74倍[21]，董文等采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）DN1產(chǎn)鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后鼠李糖脂的產(chǎn)量提高了73.97%[22]。Sen等通過響應(yīng)曲面法對影響表面肌動蛋白產(chǎn)量的培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件等進(jìn)行了優(yōu)化研究[23]。本研究通過比較菌株YL-1在不同培養(yǎng)基中嗜鐵素的產(chǎn)量，篩選出基礎(chǔ)培養(yǎng)基SM培養(yǎng)基，D405 nm/D600 nm值為1.61。隨后通過Plackett-Burman試驗(yàn)、CCD試驗(yàn)以及響應(yīng)曲面法優(yōu)化菌株YL-1發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，最終得出YL-1菌株高產(chǎn)嗜鐵素的最佳培養(yǎng)基成分：1.52 g/L丁二酸、2.00 g/L 丁二酸鈉、0.88 g/L MgSO4·7H2O、0.50 g/L （NH4）2SO4、0.50 g/L蔗糖、KH2PO4 3.49 g/L、5.44 g/L K2HPO4。模型預(yù)測的D405 nm/D600 nm值為2.25。隨后利用單因素篩選得出最佳發(fā)酵條件：溫度為26 ℃，pH值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為 36 h，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝液量為 250 mL 三角瓶裝50 mL。通過實(shí)際搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證可知，與初始SM培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后D405 nm/D600 nm值為2.36，嗜鐵素產(chǎn)量提高43.18%，優(yōu)化效果顯著。

本研究結(jié)果顯示，影響菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的主要培養(yǎng)基成分是KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、丁二酸，這與王偉的報(bào)道[24]基本一致。此外，還發(fā)現(xiàn)雖然同為假單胞菌，但不同的菌株、不同的培養(yǎng)基成分對嗜鐵素的產(chǎn)生影響很大。綠針假單胞菌YL-1產(chǎn)嗜鐵素的最適溫度為26 ℃，最適裝液量為50 mL，而夏清強(qiáng)等通過對假單胞菌P11培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為30 ℃[25];伊艷杰等研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌RB5最適裝液量為 90 mL[18]。當(dāng)然，本研究僅在搖瓶中對綠針假單胞菌YL-1產(chǎn)嗜鐵素的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，如需工廠化放大，還需要更多試驗(yàn)對其發(fā)酵工藝進(jìn)行完善，為菌株YL-1的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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