毛竹APX基因系統(tǒng)進(jìn)化與表達(dá)分析

章妮 陳克龍 崔博亮 楊陽

摘 要：? 抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase， APX）是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，尤其是葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶，也是維生素C代謝的主要酶類。該文基于生物信息學(xué)方法，利用毛竹的基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定毛竹中的APX基因家族成員，并對其編碼的蛋白基本理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、啟動子元件、系統(tǒng)進(jìn)化及共線性關(guān)系、重復(fù)串聯(lián)基因、GO注釋及表達(dá)模式進(jìn)行綜合分析，共鑒定出21種編碼APX的基因。結(jié)果表明：（1）PeAPX基因家族成員多為不穩(wěn)定疏水蛋白，基因結(jié)構(gòu)、基序及結(jié)構(gòu)域相對較為保守，大多數(shù)APX基因具有高度保守的內(nèi)含子模式。（2）系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示毛竹APX基因與水稻APX基因有著較高的同源性關(guān)系，PeAPX具有較高的進(jìn)化保守性。（3）Ka/Ks分析表明PeAPX基因都經(jīng)歷了純化選擇壓力，此外在每個APX基因的啟動子序列中發(fā)現(xiàn)有許多與應(yīng)激反應(yīng)和植物激素相關(guān)的順式作用元件，結(jié)合表達(dá)量分析，表明毛竹APX基因在毛竹生長發(fā)育中起著正向促進(jìn)作用。該研究為進(jìn)一步了解毛竹APX基因家族基本功能及其抗氧化機(jī)制提供了一定的參考，為毛竹APX基因功能的深層次鑒定提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 毛竹， APX基因家族， 生物信息學(xué)， 系統(tǒng)進(jìn)化， 基因表達(dá)

中圖分類號：? Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）12-1964-10

收稿日期：? 2020-09-25

基金項目：? 國家自然科學(xué)基金（41661023） [Supported by the National Natural Science Foundation of China （41661023）]。

作者簡介： 章妮（1997-），碩士研究生，主要從事濕地生態(tài)學(xué)研究，（E-mail）1581146264@qq.com。

通信作者：? 陳克龍，二級教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物地理與濕地生態(tài)研究，（E-mail）ckl7813@163.com。

Phylogenetic evolution and expression analysis of APX gene in Phyllostachys edulis

ZHANG Ni1，2， CHEN Kelong2，3*， CUI Boliang2， YANG Yang1，2

（ 1. College of Life Science， Qinghai Normal University， Xining 810008， China; 2. Qinghai Provincial Key Laboratory of Physical Geography and Environmental Processes， Xining 810008， China; 3. Science and Technology Department， Qinghai Normal University， Xining 810008， China ）

Abstract：? Aseorbate peroxidase （APX） is one of the important antioxidant enzymes in? the active oxygen metabolism of plants， especially the key enzyme to remove H2O2 from chloroplasts， and also the main enzyme in vitamin C metabolism. In this study， a total of 21 species encoding APX gene were identified based on bioinformatics methods， useing Phyllostachys edulis in the genome and transcriptome data to identify of PeAPX gene family members， through comprehensively analyzing its coding protein， basic physical and chemical properties， gene structure， promoter element， system evolution and the collinearity relationship， repeat the tandem， GO annotation and expression pattern. The results were as follows： （1） Most members of the PeAPX gene family were unstable hydrophobic proteins， and the gene structure， motif and domain were relatively conservative， and most APX genes have a highly conserved intron pattern. （2） Phylogenetic relationship showed that APX gene of P. edulis had high homology with APX gene of Oryza sativa， and PeAPX had a high evolutionary conservatism. （3） Ka/Ks analysis showed that all PeAPX genes experienced purified selection pressure. In addition， many cis-acting elements related to stress response and plant hormones were found in the promoter sequence of each APX gene. Combined with expression analysis， it was indicated that APX gene played a positive role in the growth and development of Phyllostachys edulis. This study provides a reference for further understanding of the basic functions of the APX gene family and its antioxidant mechanism， and provides an important reference for the in-depth identification of the functions of APX genes.

Key words： Phyllostachys edulis， APX gene family， bioinformatics， phylogenetic evolution， gene expression

植物的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生物或非生物脅迫過程均有活性氧（ROS）的產(chǎn)生（Wu & Wang， 2019）。ROS為植物細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)或O2活化衍生的代謝產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)植物對環(huán)境因素的細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用（Vaahtera et al.， 2014; Mignolet-Spruyt et al.， 2016; Pandey et al.， 2017）。其存在形式為自由基及非自由基，主要包含過氧化氫（H2O2）、羥基自由基 （-OH）、單線態(tài)氧 （1O2）、超氧陰離子自由基 （O2-）、有機(jī)氧自由基 （RO·和ROO·） 等（Fernandez-Garcia et al.， 2010; 王福祥等，2019）。而H2O2作為一類主要的ROS，也是唯一能通過質(zhì)膜水通道蛋白跨膜的分子，參與著植物細(xì)胞發(fā)育和抗逆性的調(diào)控過程，在植物代謝中起著雙重作用（Panchuk et al.， 2005; Pinheiro et al.， 2011; Ozyigit et al.， 2016）。而高水平的H2O2會導(dǎo)致植物氧化應(yīng)激并對生物大分子造成損害（Bailey-Serres et al.， 2006; Mignolet-Spruyt et al.， 2016）。因此，植物體內(nèi)開發(fā)出抗氧化系統(tǒng)通過抗氧化劑酶作用來保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害，例如抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（PRXs）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等酶維持平衡是H2O2保持穩(wěn)態(tài)水平的關(guān)鍵所在（Imahory et al.， 2008;于飛， 2013）。

APX廣泛存在于植物體內(nèi)，對H2O2有著高親和力，能通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán) （ASA-GSH） 催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，可能在H2O2清除方面發(fā)揮著特殊作用（Passardi et al.， 2007; Qin et al.， 2008; Huang et al.， 2017）。目前，擬南芥 （Arabidopsis thaliana）（Chew et al.， 2003; Panchuk et al.， 2002）、水稻 （Oryza sativa）（Teixeira et al.， 2006）、陸地棉 （Gossypium hirsutum）（Tao et al.， 2018）、玉米 （Zea mays）（任瑛等， 2014）、番茄 （Solanum lycopersicum）（Najami et al.， 2008）等多種植物中的APX基因已經(jīng)進(jìn)行了家族成員的鑒定和功能驗證方面的研究。有研究表明，APX基因參與植物生長發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)的過程，逆境響應(yīng)過程中，有特定的一種或幾種APX發(fā)揮著主要作用，保護(hù)植物體細(xì)胞免受傷害（Khanna-Chopra et al.， 2011; 李澤琴等， 2013， 2019）。

毛竹（Phyllostachys edulis）栽培歷史悠久、面積分布廣泛，是我國亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)竹種（Peng et al.， 2013）。由于其對高鹽、干旱、冷熱及病蟲害等脅迫的較強(qiáng)敏感性，從而導(dǎo)致毛竹品質(zhì)受到嚴(yán)重影響。目前對毛竹APX基因鮮有研究，本文基于已經(jīng)公布的毛竹基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫通過生物信息學(xué)分析方法鑒定毛竹APX基因家族成員，并通過分析它們的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件以及在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式，借以了解毛竹的應(yīng)激耐受性，并為進(jìn)一步研究毛竹APX的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛竹APX基因家族成員的鑒定

從竹子基因組數(shù)據(jù)庫 （BambooGDB，http：//www.bamboogdb.org/） 下載毛竹的基因組數(shù)據(jù)。以擬南芥APX 基因序列作為種子序列，通過BLASTp軟件檢索本地毛竹蛋白數(shù)據(jù)庫，篩選E值為1×e-20，從而獲得候選基因家族成員。進(jìn)一步通過seqtk軟件提取候選基因序列，提交PFAM（https：//pfam.xfam.org/）、KEGG （https：//www.genome.jp/kegg/） 和 NCBI-BLASTCDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 三大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因鑒定，從而確定毛竹APX基因家族成員。

1.2 APX基因家族基序與基因結(jié)構(gòu)分析

利用本地版MEME軟件預(yù)測APX基因的基序（motif），通過R中的ggplot2包繪制基序數(shù)目統(tǒng)計圖和基序分布圖，ggtree包繪制進(jìn)化樹，依據(jù)毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中的GFF注釋文件獲得PeAPX基因位置信息，gggenes包繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.3 APX基因家族進(jìn)化關(guān)系與保守結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI下載擬南芥、水稻、陸地棉等物種的APX基因序列，利用mafft軟件進(jìn)行多序列比對，通過fasttree軟件以最大似然法 （ML） 構(gòu)建多物種間系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設(shè)置為1 000，并通過Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測全部APX基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域，evolview（https：//www.evolgenius.info/evolview/#login）在線網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.4 APX基因家族GO注釋

利用在線軟件eggnog-mapper （http：//eggnog-mapper.embl.de/） 對PeAPX基因的生物學(xué)功能進(jìn)行GO （Gene ontology） 注釋，并通過R中的ggplot2包繪制GO注釋圖。

1.5 APX基因家族啟動子特征分析

從毛竹全基因數(shù)據(jù)庫中提取每個APX基因起始密碼子上游2 kb DNA序列，運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html）預(yù)測每條基因所含有的順勢作用元件，通過ggplot2包繪制順勢作用元件分布圖與作用元件數(shù)目統(tǒng)計圖。

1.6 APX串聯(lián)重復(fù)基因分析

使用MCscanx篩選PeAPX基因家族中的串聯(lián)重復(fù)基因，并根據(jù)gff基因注釋信息運(yùn)用Circos軟件繪制串聯(lián)重復(fù)基因的Circos圖，用KaKs_Calculator軟件計算串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks值，用ggpubr包進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.7 APX基因家族染色體定位及共線性分析

通過Mcscanx分析擬南芥、毛竹、水稻之間的共線性關(guān)系，并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，R中的circlize包繪制毛竹的染色體定位圖。

1.8 APX基因家族的組織特異性表達(dá)熱圖繪制

通過NCBI SRA 數(shù)據(jù)庫下載毛竹幼苗根組織經(jīng)萘乙酸（naphthalene acetic acid， NAA）處理的6組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登錄號：SRR5710702， SRR5710701，

SRR5710700，SRR5710699，SRR5710698，SRR5710697），并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫提供的基因表達(dá)矩陣?yán)肦中的pheatmap包繪制APX基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹PeAPX基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到21個非冗余的PeAPX基因，該基因所編碼的蛋白序列理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，21個PeAPXs成員的蛋白序列存在較大差異（表1）。毛竹PeAPX蛋白序列長度在95 （PH02Gene35594.t1）～603個 （PH02Gene07059.t1）不等，蛋白分子量為 10.9～66.0 kDa，其中以PeAPX5最大， PeAPX17最小。等電點在4.46～9.07之間， 其中14個PeAPXs成員的等電點小于7，偏酸性;6個PeAPXs成員的等電點大于7，偏堿性;PeAPX16等電點為7.03，偏中性。不穩(wěn)定指數(shù)在19.76～67.17之間，其中有6個PeAPXs蛋白為穩(wěn)定蛋白，其余15個成員均為不穩(wěn)定蛋白。親水性平均值為-0.756～-0.238，均小于0，PeAPX家族成員均為疏水蛋白。磷酸化位點個數(shù)在8～67之間。TMHMM檢測毛竹PeAPXs跨膜結(jié)構(gòu)域，有五個PeAPX家族成員均含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別為PeAPX14、PeAPX16、PeAPX18、PeAPX20、PeAPX21。

2.2 毛竹PeAPXs基因家族成員基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

如圖1所示，毛竹21條PeAPXs內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)存在較大差異，內(nèi)含子數(shù)目在1～14間不等，多數(shù)基因含有7～8個內(nèi)含子，其中PeAPX4基因長度與其余20個成員差異較大，存在一段約17 kb的非編碼序列，可能存在基因的大片段復(fù)制。通過MEME軟件對PeAPXs中的保守基序進(jìn)行搜索，以進(jìn)一步了解基序組成的多樣性和演化關(guān)系，共發(fā)現(xiàn)10個保守基序。PeAPX家族成員所含基序數(shù)量（圖2）在2～7之間，所含基序數(shù)較多的PeAPX基因家族成員N端的首個基序均為motif 4。PeAPX5的motif位置較遠(yuǎn)可能是由于該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，屬分泌蛋白。具有motif 7的蛋白均為堿性蛋白，具有motif 8的蛋白均為線粒體PeAPXs;17個PeAPX基因家族成員均有motif 5，motif 1在15個PeAPX家族成員中均有出現(xiàn)，表明這兩個基序為PeAPX家族的高度保守結(jié)構(gòu)。PeAPX14、PeAPX16、PeAPX20、PeAPX21的保守基序相差較大但仍聚為一支，可能是由于這四個成員均存在跨膜結(jié)構(gòu)域，但PeAPX18同樣存在跨膜結(jié)構(gòu)域但未能聚在一起，可能是由于缺少motif 10，表明存在motif 10的APX蛋白可能具有功能特異性。且motif 10存在跨膜結(jié)構(gòu)域，表明PeAPX18的跨膜結(jié)構(gòu)與其余存在跨膜結(jié)構(gòu)的毛竹PeAPXs跨膜序列存在差異。

2.3 毛竹PeAPXs與其他植物系統(tǒng)進(jìn)化樹及同源關(guān)系分析

為進(jìn)一步明確不同物種間APX基因的親緣關(guān)系，基于來自7種植物的83條序列構(gòu)建植物APX系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、毛果楊（Populus trichocarpa）、毛竹均為綠色種子植物，萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）為一種單細(xì)胞真核綠藻，小立碗蘚（Physcomitrella patens）則為葫蘆蘚科的一類苔蘚植物。結(jié)果顯示，83條APX蛋白序列共分為6個亞家族，毛竹PeAPXs家族中有15個成員均分別與水稻OsAPXs家族的8個成員在第Ⅰ、第Ⅳ、第Ⅵ亞家族聚在一起，可能是由于毛竹與水稻均為單子葉植物，且同屬禾本科，兩物種間有著高度同源性。PeAPXs另6個成員分別處于第Ⅲ、第Ⅴ亞家族。第Ⅱ亞家族的成員僅有陸地棉這一物種，表明這幾個成員可能存在種特異性。結(jié)構(gòu)域分析顯示， 所有序列均含有B1. 過氧化氫代謝過程; B2. 解毒; B3. 氧化-還原過程; B4. 活性氧代謝過程; B5. 對氧化應(yīng)激的反應(yīng); B6. 對刺激的反應(yīng); B7. 對壓力的反應(yīng); B8. 對有毒物質(zhì)的反應(yīng); B9. 信號; B10. 對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng); B11.抗生素分解代謝過程; B12. 抗生素代謝過程; B13. 細(xì)胞分解代謝過程; B14. 細(xì)胞代謝過程; B15. 細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng); B16. 細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng); B17. 細(xì)胞對刺激的反應(yīng); B18. 細(xì)胞對壓力的反應(yīng); B19.細(xì)胞對有毒物質(zhì)的反應(yīng); B20. 藥物分解代謝過程; B21. 藥物代謝過程; B22. 過氧化氫分解過程; B23. 廢棄的輔因子分解過程; B24. 廢棄的輔助因子代謝過程; C1. 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器; C2. 廢舊的細(xì)胞部分; C3. 細(xì)胞器小班; C4. 光合膜; C5. 質(zhì)體; C6. 質(zhì)體類囊體; C7. 質(zhì)體類囊體膜; C8. 類囊體; C9. 制備類囊體膜; C10. 細(xì)胞組分; C11. 葉綠體; C12. 葉綠體類囊體; C13. 葉綠體類囊體膜; C14. 細(xì)胞質(zhì); C15. 胞內(nèi); C16. 胞內(nèi)膜內(nèi)的細(xì)胞器; C17. 膜; C18. 膜-有界的細(xì)胞器; C19. 過時的細(xì)胞; C20. 廢棄的葉綠體部分; C21. 過時的胞質(zhì)部分; C22. 過時的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器部分; C23. 細(xì)胞內(nèi)廢棄部分; C24. 殘余的細(xì)胞器部分; C25. 廢棄的質(zhì)體部分; C26. 陳舊的類囊體部分; C27. 細(xì)胞器; M1. 抗氧化活性; M2. 催化活性; M3. 細(xì)胞色素-c過氧化物酶活性; M4. 分子功能; M5. 氧化還原酶活性; M6. 過氧化物酶活性。

B1. Hydrogen peroxide metabolic process; B2. Detoxification; B3. Oxidation-reduction process; B4. Reactive oxygen species metabolic process; B5. Response to oxidative stress; B6. Response to stimulus; B7. Response to stress; B8. Response to toxic substance; B9. Signaling; B10. Response to chemical; B11. Antibiotic catabolic process; B12. Antibiotic metabolic process; B13. Cellular catabolic process; B14. Cellular metabolic process; B15. Cellular response to chemical stimulus; B16. Cellular response to oxidative stress; B17. Cellular response to stimulus; B18. Cellular response to stress; B19. Cellular response to toxic substance; B20. Drug catabolic process; B21. Drug metabolic process; B22. Hydrogen peroxide catabolic process; B23. Obsolete cofactor catabolic process; B24. Obsolete cofactor metabolic process; C1. Intracellular organelle; C2. Obsolete cell part; C3. Organelle subcompartment; C4. Photosynthetic membrane; C5. Plastid; C6. Plastid thylakoid; C7. Plastid thylakoid membrane; C8. Thylakoid; C9. Thylakoid membrane; C10. Cellular component; C11. Chloroplast; C12. Chloroplast thylakoid; C13. Chloroplast thylakoid membrane; C14. Cytoplasm; C15. Intracellular; C16. Intracellular membrane-bounded organelle; C17. Membrane; C18. Membrane-bounded organelle; C19. Obsolete cell; C20. Obsolete chloroplast part; C21. Obsolete cytoplasmic part; C22. Obsolete intracellular organelle part; C23. Obsolete intracellular part; C24. Obsolete organelle part; C25. Obsolete plastid part; C26. Obsolete thylakoid part; C27. Organelle; M1. Antioxidant activity; M2. Catalytic activity; M3. Cytochrome-c peroxidase activity; M4. Molecular function; M5. Oxidoreductase activity; M6. Peroxidase activity.

GARE-motif.? 赤霉素響應(yīng)元件; AuxRE， TGA-element， AuxRR-core. 生長素響應(yīng)元件; CGTCA-motif， TGACG-motif. 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件; ABRE. 脫落酸響應(yīng)元件; TCA-element. 水楊酸響應(yīng)元件; LTR. 低溫響應(yīng)元件; MBS. 干旱誘導(dǎo)元件; ARE. 厭氧誘導(dǎo)元件; TC-rich-repeats. 防御及脅迫響應(yīng)元件; GC-motif. 缺氧誘導(dǎo)元件; WUN-motif. 機(jī)械損傷響應(yīng)元件; O2-site. 蛋白代謝調(diào)控元件; RY-element， plant_AP-2-like. 種子特異性調(diào)控元件; circadian. 晝夜節(jié)律控制元件; Box-Ⅱ-like-sequence. 順式作用監(jiān)管元件; GCN4_motif. 胚乳表達(dá)元件; MBSI. 黃酮生物合成調(diào)控元件; 3-AF3-binding-site. 部分保守DNA序列元件。

GARE-motif. Gibberellin response element; AuxRE， TGA-element， AuxRR-core. Auxin response element; CGTCA-motif， TGACG-motif. Methyl jasmonate response element; ABRE. Abscisic acid response element; TCA-element. Salicylic acid response element; LTR. Low temperature response element; MBS. Drought-inducing element; ARE. Anaerobic-inducing element; TC-rich-repeats. Defense and stress response elements; GC-motif. Anoxic-inducing element; WUN-motif. Mechanical damage response element; O2-site. Regulatory elements of protein metabolism; RY-element， plant_AP-2-like. Seed-specific regulatory elements; circadian. Circadian rhythm control elements; Box-Ⅱ-like-sequence. Cis-acting supervisory element; GCN4_motif. Endosperm expression element; MBSI. Regulatory elements for flavonoid biosynthesis; 3-AF3-binding-site. Partially conserved DNA sequence elements.Peroxidase這一蛋白結(jié)構(gòu)域，毛竹PeAPX家族成員中存在結(jié)構(gòu)域長度的變化，結(jié)構(gòu)域較短的PeAPX家族成員分子量均較小。

2.4 毛竹PeAPX GO注釋分析

毛竹PeAPX的GO注釋（圖4）表明，所有基因被注釋到3大類，分別為生物過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function），以分子功能注釋結(jié)果占比最少，生物過程和細(xì)胞組分注釋結(jié)果居多。生物過程分類主要聚集于細(xì)胞物質(zhì)代謝過程，細(xì)胞組分分類中多為細(xì)胞器和類囊體，分子功能分類則表現(xiàn)為酶活性富集。由此可推斷PeAPX在毛竹的生長發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮了較大作用。

2.5 毛竹PeAPXs順式作用元件分析

分析PeAPXs基因家族編碼區(qū)起始密碼子上游2 kb區(qū)域內(nèi)的啟動子序列，結(jié)果表明PeAPXs啟動子序列上游均含有典型的TATA-box這一核心順式作用元件，同時存在大量信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的激素響應(yīng)元件、非生物逆境脅迫響應(yīng)元件及生長發(fā)育相關(guān)的表達(dá)調(diào)控元件（圖5），可能參與相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控過程。其中非生物逆境脅迫響應(yīng)元件包括低溫、厭氧、缺氧、防御及脅迫等響應(yīng)元件，表明毛竹PeAPX基因家族成員在毛竹抗逆過程中與各類應(yīng)激反應(yīng)息息相關(guān)。不同的毛竹PeAPX基因所含的順式作用元件類別及數(shù)量存在差異（圖5：B），脫落酸響應(yīng)元件 （ABRE） 在毛竹PeAPX基因家族的大多成員中數(shù)量占比較大，表明PeAPXs主要在毛竹的成熟過程中起到了促進(jìn)作用，PeAPX7的激素響應(yīng)元件為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，可促進(jìn)植物體成熟，其余元件多為非生物脅迫響應(yīng)元件，表明其主要在毛竹抗逆過程中發(fā)揮作用。

2.6 不同物種串聯(lián)重復(fù)基因分析及毛竹PeAPX家族染色體定位、共線性分析

利用Ka/Ks值 [非同義替換位點替換次數(shù)（Ka）與同義替換位點替換次數(shù)（Ks）的比值]來估計毛竹（PeAPX）、陸地棉（GhAPX）、擬南芥（AtAPX）、水稻（OsAPX）的APX基因家族成員的進(jìn)化選擇模式，比值均小于1（圖6），表明各物種的APX基因家族成員都為純化選擇。毛竹PeAPX基因家族21個家族成員定位于13條染色體上（圖7：A），不同染色體基因分布密度存在差異，以s13密度居高，PeAPX6、PeAPX16均定位于該染色體;以單染色體來看，s23分布的家族成員最多，出現(xiàn)了4個PeAPX基因。毛竹、擬南芥、水稻的共線性關(guān)系表明（圖7：B），僅有5個APX同源蛋白基因出現(xiàn)在擬南芥染色體中，水稻染色體中的APX同源蛋白基因為12個，表明毛竹與水稻的親緣關(guān)系更近。擬南芥中的APX家族成員部分在毛竹中有對應(yīng)的多個同源拷貝，可推斷APX基因家族在演化過程中可能存在全基因組多倍化事件。

2.7 毛竹APX基因家族的組織特異性表達(dá)

依據(jù)不同PeAPX蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)繪制熱圖 （圖8） 以探究毛竹APX基因的潛在功能。21個PeAPX基因家族成員經(jīng)萘乙酸處理后，大部分成員呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢，僅PeAPX1、PeAPX2、PeAPX4及PeAPX12表達(dá)顯著下調(diào)，表明萘乙酸處理下，能夠促進(jìn)毛竹PeAPX家族成員的表達(dá)，PeAPX家族成員在毛竹的生長發(fā)育過程中可能起到了重要的正向促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

APX基因，作為一類普遍存在的抗氧化酶類基因，在植物生長發(fā)育和脅迫耐受性等方面的各種生物學(xué)過程中均起著重要作用（Fryer et al.， 2003; Davletova et al.， 2008; Pandey et al.， 2017）。毛竹基因組及轉(zhuǎn)錄組的成功破譯為研究毛竹中APX基因的進(jìn)化和趨異奠定了堅實基礎(chǔ)。本文旨在鑒定毛竹中APX基因特定的細(xì)微變化，從而更全面地了解PeAPXs的各項功能并揭示其調(diào)控機(jī)制。本研究中，經(jīng)分析鑒定得出毛竹APX基因家族成員共21個，定位在13條scaffold上。相較于擬南芥、水稻等植物只有8條APX（Panchuk et al.， 2002; Chew et al.， 2003; Teixeira et al.， 2006），種間數(shù)量差異極為明顯，可推測毛竹APX基因可能存在大量串聯(lián)重復(fù)序列和大片段復(fù)制。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，毛竹中的APX基因遵循與其植物相似的分布模式， 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析PeAPX分布于5個亞家族，同組內(nèi)PeAPX基因間親源關(guān)系較近，這可能是由于其基因結(jié)構(gòu)高度保守所導(dǎo)致;基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果也表明PeAPX基因存在著高度保守的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。不同組間其親源關(guān)系較遠(yuǎn)，表明PeAPX基因家族具有明顯的功能多樣性。長期的進(jìn)化過程中，選擇壓力在塑造基因家族中起著重要作用，從而導(dǎo)致基因家族之間的進(jìn)化模式不同（Teixeira et al.， 2006），對毛竹的研究表明PeAPX串聯(lián)重復(fù)基因的Ka/Ks比值均小于1，這表明PeAPX基因家族已經(jīng)經(jīng)歷了純化選擇壓力。

從PeAPX基因家族啟動子元件的預(yù)測結(jié)果可知，所有成員的啟動子區(qū)域均含有大量與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如GARE-motif、ABRE等，表明它們廣泛參與了毛竹生長發(fā)育過程中的逆境脅迫應(yīng)答，對調(diào)控植物生長發(fā)育、抵抗逆境脅迫過程起著重要作用。王兵等（2020）對毛白楊A(yù)PX的過表達(dá)研究表明APX的高表達(dá)量提高了植物體的抗逆能力。Pnueli et al.（2003）的研究也表明APX基因的缺乏致使擬南芥植物體生長受限?；虮磉_(dá)模式通常與其功能密切相關(guān)，對差異表達(dá)譜的分析可以為研究基因家族提供重要信息（Guo et al.， 2008）。通過NAA對毛竹進(jìn)行脅迫處理與對照組相比，發(fā)現(xiàn)大部分基因的表達(dá)量均處于上升趨勢，這有可能源于逆境激活了某種潛在的轉(zhuǎn)錄因子，而這種轉(zhuǎn)錄因子又作用于APX基因，誘導(dǎo)其大量表達(dá)來促使植物更好地適應(yīng)外界環(huán)境。APX基因的表達(dá)對植物抗逆及生長發(fā)育能力均存在一定程度的影響，已有研究表明APX基因突變會嚴(yán)重影響蛋白穩(wěn)定性（Wu et al.， 2018），另有研究表明APX基因可保護(hù)細(xì)胞器免受損傷（Davletova et al.， 2005），推測植物激素可能與抗逆基因的表達(dá)息息相關(guān)。

毛竹的生長發(fā)育與抗逆基因的表達(dá)密切相關(guān)。通過對毛竹進(jìn)行APX基因家族的鑒定和詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，毛竹的APX基因家族在進(jìn)化過程中發(fā)生了分化，并對各種非生物脅迫產(chǎn)生了廣泛的響應(yīng)。這種發(fā)現(xiàn)有利于了解毛竹在應(yīng)對惡劣環(huán)境的適應(yīng)性，并為PeAPX進(jìn)一步的功能分析提供基礎(chǔ)，未來可從蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方面對基因功能進(jìn)行更詳盡的研究。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）