灘羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)及成肌和成脂誘導(dǎo)分化研究

徐小春，趙 瑞，陳文娟，馬文平，馬 森

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skelatal muscle satellite cells，SMSCs)是位于骨骼肌纖維基底板下的一小群肌原性干細(xì)胞[1]，因直接參與骨骼肌分化而受到廣泛關(guān)注[2-4]。在肌發(fā)生過(guò)程中，刺激成肌細(xì)胞啟動(dòng)表達(dá)肌源性分化特異性基因，如中間絲蛋白(desmin)[5]、配對(duì)盒基因7(Pax7)[5-6]、肌肉細(xì)胞生成素(MyoG)[7]、肌球蛋白重鏈(MHC)[8]。SMSCs活化后表達(dá)肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Pax7和MyoD[9]，分化后表達(dá)肌原蛋白desmin，參與運(yùn)動(dòng)，并可用于識(shí)別其他組織中的骨骼肌細(xì)胞[10]。因此，MyoG和MHC是骨骼肌發(fā)育的調(diào)控因子，可促進(jìn)SMSCs向成熟肌細(xì)胞分化，并作為SMSCs分化的標(biāo)志物。SMSCs是參與生長(zhǎng)后肌肉再生的最重要的細(xì)胞類型，通過(guò)對(duì)SMSCs成肌分化的調(diào)控可以有效改善畜禽的肉品質(zhì)。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種多功能干細(xì)胞，既可以向成肌細(xì)胞分化，也可以向脂肪細(xì)胞分化[11-12]。研究證明，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)是調(diào)節(jié)脂肪形成的主要轉(zhuǎn)錄因子，并且不同程度地調(diào)控脂肪的發(fā)育。脂肪酸合成酶(FAS)在調(diào)控脂肪酸合成及脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要作用，因此常被作為檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志基因[13-14]。目前灘羊優(yōu)良肉質(zhì)性狀的體內(nèi)研究形成機(jī)制尚不清楚，因此獲取便捷的體外研究材料對(duì)深入揭示其優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成分子機(jī)制具有重要意義，而SMSCs正是一種理想的研究材料。本研究通過(guò)對(duì)灘羊SMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定，同時(shí)建立SMSCs成肌和成脂誘導(dǎo)分化體系的，以期為在體外條件下研究調(diào)控灘羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及脂肪沉積的分子機(jī)制提供模型。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

選取10日齡健康灘羊公羔1只(寧夏鹽池縣春浩林草產(chǎn)業(yè)專業(yè)合作社提供)，頸部處死后無(wú)菌條件下采取背最長(zhǎng)肌組織，放于加雙抗的(100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)無(wú)菌磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中備用。0.1%I型膠原酶(Gibco，美國(guó))、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco，美國(guó))、馬血清(Hyclone，美國(guó))、DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma，美國(guó))、0.25%胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))、青鏈霉素(Gibco，美國(guó))、OriCell SD大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(Cyagen Biosciences，中國(guó))、油紅O染料(Sigma，美國(guó))、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；Sigma, 美國(guó))、RNA提取試劑盒(Takara，日本)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)、實(shí)時(shí)熒光定量qPCR Mix(Takara，日本)、0.1%明膠(Sigma，美國(guó))、0.1%多聚賴氨酸(Sigma，美國(guó))、0.1%TritonX-100(Sigma，美國(guó))、4%多聚甲醛(Solarbio，中國(guó))、封閉用山羊血清(中杉金橋，中國(guó))、MHC一抗(Bioss，中國(guó))、Desmin二抗(FITC標(biāo)記羊抗兔二抗)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT(Sigma，美國(guó))等。

1.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)

采取腿部肌肉組織，用含有雙抗的PBS溶液沖洗5次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。剔除肉眼可見(jiàn)的血管和結(jié)締組織，用手術(shù)剪刀剪成約0.5～1.0 mm的組織塊。先加入0.1%I型膠原酶于37 ℃水浴鍋中消化組織50 min，然后加入0.25%胰蛋白酶(Gibco)消化組織10～20 min(振蕩1次/10 min)，在消化完全后加入等體積的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+20% FBS+10%馬血清+100 IU/mL青鏈霉素)終止消化。將消化液過(guò)孔徑為200目的細(xì)胞篩，濾液1 000 r/min離心10 min，棄上清，得到細(xì)胞即為SMSCs。將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種在包被的培養(yǎng)皿中(0.1%明膠+0.1%聚賴氨酸)，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，將上清加入到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，后再次吸取上清到新的培養(yǎng)皿中，此時(shí)獲得細(xì)胞為含雜細(xì)胞較少的SMSCs。

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)匯合至80%～90%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化約3 min，顯微鏡下待細(xì)胞回縮并且少量細(xì)胞飄起時(shí)，加入等體積的完全培養(yǎng)液終止消化。收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2或1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，之后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔2 d換液1次，直到細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至90%，并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

原代細(xì)胞培養(yǎng)匯合至80%～90%時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔密度為1.0×105個(gè)/mL，隨機(jī)分為7組，每組3孔。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力：每孔加入MTT 20 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄MTT溶液，加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)處讀取OD值，每隔48 h進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置空白調(diào)零，計(jì)算每孔吸光度值的平均值，繪制曲線，即為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.5 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞誘導(dǎo)分化

第二代細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合度時(shí)分別進(jìn)行成肌和成脂誘導(dǎo)分化。將SMSCs接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待SMSCs生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，PBS清洗細(xì)胞2次，6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入成肌分化培養(yǎng)基(98% DMEM/F12+2%馬血清)誘導(dǎo)SMSCs成肌分化，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)誘導(dǎo)SMSCs成肌分化8 d，每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)液。

將SMSCs接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待SMSCs生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，PBS清洗細(xì)胞2次，加入OriCell SD大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液72 h，后換以O(shè)riCell B液培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，重復(fù)上述處理兩次共8 d。

1.6 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的免疫熒光鑒定

利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)成肌誘導(dǎo)分化4 d后的SMSCs標(biāo)記蛋白MHC進(jìn)行鑒定。將SMSCs接種至6孔板內(nèi)，按上述流程誘導(dǎo)分化4 d后，吸除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗3次；0.25%TritonX-100通透15 min，PBS清洗3次；10%山羊血清封閉液封閉1 h，PBS清洗3次；MHC一抗(1:100稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；PBS清洗3次， FITC(1:100稀釋)標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h；PBS清洗3次；DAPI室溫孵育15 min；共聚焦顯微鏡拍照。

1.7 油紅O染色法及鑒定

SMSCs成脂誘導(dǎo)成熟后，棄完全培養(yǎng)基，PBS洗2次。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，油紅O染色60 min，棄染色液，PBS洗2次，倒置顯微鏡下觀察。用60%異丙醇進(jìn)行萃取，測(cè)定萃取液在510 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.8 引物設(shè)計(jì)及合成

參照GenBank中Pax7、Desmin、MyoG、PPARγ、C/EBPα、FAS基因序列，用Primer Premier 5.0及NCBI軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物相關(guān)信息Table 1 Related information about the primers used for qRT-PCR

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

分別在SMSCs成肌、成脂誘導(dǎo)第0、2、4、6、8 d提取總RNA，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系20 μL：其中Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，39個(gè)循環(huán)，65～95 ℃熔解曲線5 s。

1.10 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

新分離的SMSCs培養(yǎng)2 h后，大部分非特異性細(xì)胞已經(jīng)附著。大多數(shù)非附著的SMSCs隨培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的明膠處理的培養(yǎng)板中以促進(jìn)粘附生長(zhǎng)。新分離的SMSCs呈球形，具有較強(qiáng)的折射率。9 h后，細(xì)胞開(kāi)始附著在細(xì)胞培養(yǎng)皿上，貼壁細(xì)胞呈橢圓形、梭形或多角形(圖1A)；2 d后細(xì)胞全部附著，細(xì)胞逐漸向梭形或多邊形延伸(圖1B)；培養(yǎng)至4 d時(shí)，細(xì)胞形態(tài)與第二天相似，細(xì)胞數(shù)目增多(圖1C)；培養(yǎng)至8 d時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形且平行排列緊密(圖1D)。

圖1 SMSCs的原代培養(yǎng)(100×)A～D. SMSCs原代培養(yǎng)9 h、2 d、4 d和8 dFig.1 Primary culture of SMSCs (100×)A～D. Primary culture of SMSCs for 9 h, 2 d, 4 d, and 8 d, respectively

培養(yǎng)匯合至90%時(shí)傳代培養(yǎng)，與原代細(xì)胞相比，傳代SMSCs的增殖能力明顯增強(qiáng)。在培養(yǎng)皿中，接種第二代細(xì)胞第2天，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞形態(tài)正常(圖2A)。傳代第4、6天細(xì)胞呈現(xiàn)梭形及不規(guī)則三角形，可見(jiàn)部分融合細(xì)胞，折射率增加；在培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)生了更多的融合(圖2B、圖2C)；培養(yǎng)至8 d時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)梭形且平行排列緊密，呈長(zhǎng)管狀，體積明顯大于單個(gè)SMSCs(圖2D)。

圖2 SMSCs的傳代培養(yǎng)(100×)A～D. 傳代培養(yǎng)2 d、4 d、6 d和8 dFig. 2 Subculture of SMSCs (100×)A～D. Subculture of SMSCs for 2 d, 4 d, 6 d, and 8 d, respectively

2.2 SMSCs的成肌誘導(dǎo)分化及免疫熒光鑒定

體外培養(yǎng)SMSCs至匯合度到60%～70%加入成肌誘導(dǎo)液，第2天開(kāi)始有方向不一致的SMSCs相互融合，形成短小的肌管細(xì)胞(圖3A)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度增大，細(xì)胞之間的融合更為廣泛，肌管細(xì)胞的形成明顯增加(圖3B)。誘導(dǎo)至第6天，肌管細(xì)胞之間也開(kāi)始出現(xiàn)相互的連接和融合，連接成片狀、網(wǎng)狀(圖3C)。誘導(dǎo)至第8天，細(xì)胞呈長(zhǎng)管狀，體積明顯大于單個(gè)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，各肌管細(xì)胞之間出現(xiàn)拉網(wǎng)和連接現(xiàn)象，最終彼此融合(圖3D)。在SMSCs成肌誘導(dǎo)分化第8天，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MHC的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在分化第8天可以明顯觀察到呈染色陽(yáng)性的細(xì)胞核(圖3E)和肌管(圖3F)。

圖3 SMSCs的成肌誘導(dǎo)及鑒定(100×)A～D. 誘導(dǎo)分化2、4、6、8 d；E，F(xiàn). MHC免疫熒光鑒定(誘導(dǎo)分化第8天)Fig. 3 Induced differentiation of SMSCs towards myogenic cells and identification (100×) A～D. Induced differentiation of SMSCs towards myogenic cells at 2, 4, 6, and 8 d, respectively；E,F. MHC immunofluorescence identification (8th day post-induction)

2.3 SMSCs成脂誘導(dǎo)分化及油紅O染色

SMSCs在成脂分化培養(yǎng)基的作用下，隨著時(shí)間的增加，長(zhǎng)梭形細(xì)胞縮短成不規(guī)則三角形及片狀(圖4A和圖4B)，在誘導(dǎo)第6天時(shí)能觀測(cè)到有少量脂滴形成(圖4C)，在第8天時(shí)細(xì)胞內(nèi)沉積大量脂滴(圖4D)。油紅O染色后，細(xì)胞內(nèi)脂滴被油紅O著色而成紅色，說(shuō)明SMSCs已經(jīng)被成功誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞(圖4E(100×)和圖4F(200×)。

2.4 生長(zhǎng)曲線

SMSCs接種后的潛伏期為0～4 d，此時(shí)完成細(xì)胞的貼壁和伸展。4～6 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖迅速，第6天后開(kāi)始進(jìn)入到平臺(tái)期，細(xì)胞增殖緩慢。觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，已有部分SMSCs開(kāi)始相互融合形成散在的肌管細(xì)胞(圖5)。

2.5 SMSCs成肌、成脂誘導(dǎo)前后相關(guān)基因表達(dá)差異比較

SMSCs成肌誘導(dǎo)分化前后Pax7、MyoG和Desmin的表達(dá)量有顯著性變化(圖6A)。SMSCs成肌誘導(dǎo)第8天Pax7表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，為誘導(dǎo)第0天的0.08倍；SMSCs成肌誘導(dǎo)第8天MyoG和Desmin表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，分別是誘導(dǎo)第0天的11.03倍和5.48倍。SMSCs成脂誘導(dǎo)分化第8天與誘導(dǎo)第0天相比，PPARγ表達(dá)量增加，但差異不顯著(P>0.05)；C/EBPα和FAS的表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)(圖6B)；SMSCs成脂誘導(dǎo)第8天C/EBPα和FAS表達(dá)量分別是誘導(dǎo)第0天的5.51倍和2.01倍。

圖4 MDSCs的成脂誘導(dǎo)及鑒定A～D. 誘導(dǎo)分化2、4、6、8天；E，F(xiàn). 油紅O染色(誘導(dǎo)分化第8天)Fig. 4 Induced differentiation of MDSCs towards adipogenic cells and identificationA～D. Induced differentiation of MDSCs towards adipogenic cells at 2, 4, 6, and 8 d, respectively；E,F. Oil red O staining (8th day post-induction)

圖5 SMSCs生長(zhǎng)曲線Fig. 5 The growth curve of SMSCs

3 討 論

3.1 SMSCs分離培養(yǎng)

SMSCs是位于肌膜和基底膜之間的一類肌源性干細(xì)胞，直接參與骨骼肌分化，是脊椎動(dòng)物出生后調(diào)節(jié)肌肉再生長(zhǎng)的最主要方式。一般情況下，SMSCs處于休眠狀態(tài)，當(dāng)肌肉受到損傷或者受到外界信號(hào)的刺激誘導(dǎo)后，肌肉組織的再生主要由肌衛(wèi)星細(xì)胞完成的。SMSCs在幼齡動(dòng)物肌肉組織中占的比例較高，但是其總體數(shù)量和肌肉組織細(xì)胞占比會(huì)隨著動(dòng)物年齡增加而不斷減少[15]。目前，羊、牛、豬、雞等畜禽的SMSCs的分離培養(yǎng)已經(jīng)被報(bào)道。SMSCs的分離方法主要有組織塊培養(yǎng)法和酶消化法兩種，其中酶消化分離法主要有膠原酶法和胰蛋白酶法等[16-19]。本研究利用0.1%I型膠原酶和0.25%酶兩步消化法成功地分離了灘羊SMSCs，并對(duì)其進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)鑒定。鄭琪等[20]使用10%馬血清的培養(yǎng)基對(duì)安淮山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)；解一凡等[21]采用15%馬血清血清培養(yǎng)基對(duì)哈薩克羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)。本研究采用10%馬血清的培養(yǎng)基對(duì)灘羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)，并進(jìn)一步利用差速貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。兩步消化法使得細(xì)胞充分釋放，差速貼壁法可以去掉成纖維細(xì)胞，獲得的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代后純度較高，增殖和分化能力較強(qiáng)。新分離的、未激活的SMSCs處于休眠狀態(tài)，很難附著在未處理的培養(yǎng)皿底部[21]，本研究采用0.1%明膠和0.1%聚賴氨酸對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行包被，明膠和聚賴氨酸有助于綿羊SMSCs的附著。

圖6 SMSCs成肌、成脂誘導(dǎo)前后相關(guān)基因的表達(dá)“*”表示2組數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)Fig. 6 Expression of genes involved in myogenic and adipogenic potentials of SMSCs before and after induced differentiation“*” indicates significant difference between two data sets (P<0.05)

3.2 SMSCs的誘導(dǎo)分化及鑒定

SMSCs在未激活和已激活狀態(tài)表達(dá)不同的基因或蛋白質(zhì)，其中一些已經(jīng)被用作標(biāo)記物利用免疫熒光、蛋白印記等技術(shù)對(duì)SMSCs進(jìn)行分子鑒定或者細(xì)胞狀態(tài)的識(shí)別。目前，研究證實(shí)SMSCs表達(dá)骨骼肌標(biāo)志性蛋白如MHC、Desmin、Pax7、MyoD、MyoG等[16，22-24],已經(jīng)證實(shí)SMSCs能夠合成骨骼肌特異性的蛋白。例如，MHC作為表皮生長(zhǎng)因子超家族的一員，已被證明在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用，常作為成肌標(biāo)記基因。正常的成肌細(xì)胞中會(huì)表達(dá)MHC，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)MHC的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，可以說(shuō)明該細(xì)胞是否為成肌細(xì)胞。本研究結(jié)果表明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中MHC的表達(dá)呈陽(yáng)性，證實(shí)分離得到的SMSCs可誘導(dǎo)分化成為成肌細(xì)胞。SMSCs除了具有成肌潛力以外，還具有向成脂細(xì)胞和成骨的潛力。本研究采用成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)灘羊SMSCs分化為類脂肪細(xì)胞，油紅O染色鑒定發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)8d后細(xì)胞內(nèi)有明顯脂肪滴形成，表明分離的灘羊SMSCs亦具有成脂細(xì)胞的潛力，可以作為細(xì)胞模型探究相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。

3.3 SMSCs成肌、成脂誘導(dǎo)前后相關(guān)基因表達(dá)差異比較

SMSCs從靜息狀態(tài)到激活狀態(tài)，再?gòu)募せ顮顟B(tài)到成肌分化形成成熟的肌纖維受到有序復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，精準(zhǔn)控制SMSCs發(fā)揮其生物學(xué)功能。靜止和激活SMSCs最廣泛使用的標(biāo)記物是Pax7，這是一種屬于參與肌肉發(fā)育的螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋-配對(duì)盒家族的轉(zhuǎn)錄因子[25]。Myogenin(MyoG)是最后的MRFs之一，參與了發(fā)育和再生過(guò)程中肌肉分化的晚期階段，特別是在成肌細(xì)胞肌管和成熟纖維的形成中[26]。隨著MyoG的表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入生肌分化階段，最后MHC基因表達(dá)，標(biāo)志著生肌分化進(jìn)入最后時(shí)期[27]。結(jié)蛋白(desmin)是中間絲蛋白的一種，是靜止的衛(wèi)星細(xì)胞和增殖的成肌細(xì)胞標(biāo)志之一，在損傷后再生的肌纖維以及雞、大鼠和小鼠等的胚胎成肌纖維中表達(dá)[28]。肌細(xì)胞的生成和分化過(guò)程由Pax7和MRFs家族成員相互作用共同參與，Pax7在靜止的肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá), 激活后則同時(shí)表達(dá)Pax7和MyoD。肌衛(wèi)星細(xì)胞激活后,Pax7正調(diào)控下游基因Myf5、MyoD、myogenin和MRF4，它們介導(dǎo)骨骼肌標(biāo)志基因的表達(dá)并誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，SMSCs成肌誘導(dǎo)分化前后Pax7表達(dá)量顯著降低，而MyoG和Desmin的表達(dá)量表達(dá)量顯著增加。原代山羊肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過(guò)程中Pax7基因顯著下調(diào)，MyoG基因與Desmin基因顯著上調(diào)[30], 這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。靜息狀態(tài)下的肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)Pax7，進(jìn)入活化階段后，Pax7表達(dá)下調(diào)，最終分化進(jìn)入晚期階段，MHC開(kāi)始表達(dá)，說(shuō)明肌細(xì)胞逐漸停止增殖，并開(kāi)始分化、融合。研究證明SMSCs能在體外分化為成脂細(xì)胞[31-32]。PPARγ和C/EBPα是參與脂肪細(xì)胞成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，C/EBPα被激活后能上調(diào)其他成脂分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的成脂分化[30,33]。本研究發(fā)現(xiàn)，SMSCs成脂誘導(dǎo)分化后C/EBPα和FAS的表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明C/EBPα激活后上調(diào)FAS的表達(dá)量，促進(jìn)SMSCs的成脂分化。這說(shuō)明通過(guò)改變誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞能夠分化成為脂肪細(xì)胞，并且成脂相關(guān)的基因PPARγ、C/EBPα和FAS的表達(dá)量均呈現(xiàn)了上升趨勢(shì)，此結(jié)果與細(xì)胞染色結(jié)果完全相符。這可能是由于部分細(xì)胞已分化為類脂肪細(xì)胞，成脂標(biāo)志性基因開(kāi)始特異性表達(dá)，也可能受到脂肪酸沉積的影響，同時(shí)也可能受到PPARγ和C/EBPα的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)I型膠原酶和胰蛋白酶消化分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，并利用差速貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，所分離的細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代后純度較高，增殖和分化能力較強(qiáng)。成肌和成脂誘導(dǎo)分化分別通過(guò)免疫熒光和油紅O染色鑒定所分離的細(xì)胞為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，并且具有成肌和成脂分化能力。MDSCs成肌誘導(dǎo)分化前后Pax7、MyoG和Desmin的表達(dá)量有顯著性變化，MDSCs成肌誘導(dǎo)第8天Pax7表達(dá)量顯著降低，MyoG和Desmin表達(dá)量顯著增加；MDSCs成脂誘導(dǎo)分化第8天與誘導(dǎo)第0天相比；C/EBPα和FAS的表達(dá)量顯著增加。灘羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成功分離培養(yǎng)為灘羊骨骼肌的發(fā)育及再生機(jī)制，提供了可靠的細(xì)胞模型。