基于線粒體COⅠ基因的畜禽肉中鴨源性成分鑒別方法研究

盛中偉，唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，陸俊賢，高玉時(shí)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225125)

民以食為天，食以安為先，從源頭做好動(dòng)物源性食品安全，對(duì)保障人民群眾身體健康和維護(hù)社會(huì)公共衛(wèi)生安全具有重要意義[1]。目前，肉與肉制品摻雜、摻假是重要的食品質(zhì)量安全問(wèn)題之一，“掛鵝頭賣(mài)鴨肉”、“假羊肉”、“牛肉膏”等畜禽肉摻假事件頻繁發(fā)生，嚴(yán)重威脅到消費(fèi)者的健康和利益，如何快速有效地鑒別出畜禽肉中其它動(dòng)物源性成分，關(guān)系到國(guó)計(jì)民生，也是各級(jí)質(zhì)監(jiān)部門(mén)對(duì)市場(chǎng)秩序維護(hù)的迫切需要。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)逐漸產(chǎn)生[2-4]，特別是熒光定量PCR技術(shù)的快速發(fā)展為肉類(lèi)成分源性檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑[5-8]。陸俊賢等[9]以豬特異性基因序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，建立了基于熒光PCR法的豬源性成分快速檢測(cè)方法。侯東軍等[10]根據(jù)線粒體環(huán)氧酶Ⅲ、細(xì)胞色素b和線粒體D-loop基因序列，分別設(shè)計(jì)了鴨、牛和豬特異性引物，并應(yīng)用SYBR實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，定性識(shí)別了鴨、牛和豬源性成分。Dooley等[11]基于線粒體DNA細(xì)胞色素b基因，分別建立了畜禽肉中牛源性、豬源性、羊源性、雞源性和火雞源性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

動(dòng)物線粒體基因組DNA具有母系遺傳、獨(dú)立的核外遺傳密碼以及進(jìn)化速率快等優(yōu)點(diǎn)，而且具有高度的物種特異性和多拷貝數(shù)，因此線粒體DNA多態(tài)性位點(diǎn)已成為設(shè)計(jì)肉類(lèi)成分源性檢測(cè)的首選靶點(diǎn)[12-13]。其中COⅠ基因在動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化、種類(lèi)鑒別和群體遺傳多樣性研究等方面得到廣泛應(yīng)用[14]。陳海港等[15]通過(guò)對(duì)mtDNA中COⅠ基因特異性位點(diǎn)比對(duì)和分析，設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)特異性引物XW1，成功的區(qū)分出云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧兩個(gè)物種。齊春萌等[16]根據(jù)鴕鳥(niǎo)mtDNACOⅠ基因序列特異性設(shè)計(jì)特異性引物，建立了肉制品中鴕鳥(niǎo)源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定方法。本研究擬根據(jù)鴨線粒體DNACOⅠ基因的差異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)篩選出鴨特異性引物，建立基于線粒體DNACOⅠ基因熒光定量PCR技術(shù)的畜禽肉中鴨源性成分快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬肉、牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿肉和鵪鶉肉攪碎混勻成肉糜狀，-20 ℃保存?zhèn)溆?；基因組DNA抽提試劑盒 北京天根生化科技有限公司；2×PCR Mix 南京博爾迪生物科技有限公司；熒光染料預(yù)混液SYBR Green mix：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 2500rxn 南京諾唯贊生物科技有限公司；電泳上樣緩沖液 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒分別提取9種動(dòng)物肌肉組織DNA，同時(shí)將鴨肉DNA按10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍以及108倍等8個(gè)梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)４嬗?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 以Genbank上公布的豬、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝、鴿和鵪鶉等9種動(dòng)物線粒體DNACOⅠ基因序列為靶基因，通過(guò)Arraydesigner 2.0、Oligo 6.0、Bioedit、Primer Premier 5.0等軟件比對(duì)分析，設(shè)計(jì)合成鴨特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列、Tm值及PCR產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence，Tm value and the size of PCR product

1.2.3 常規(guī)PCR反應(yīng)體系和條件 20 μL反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol/L正向、反向引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，雙蒸滅菌水8.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min； 95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件 15 μL反應(yīng)體系：Master Mix(2×) 7.5 μL；Dye 0.3 μL；1 μmol/L正向、反向引物各0.3 μL；DNA模板1 μL；雙蒸滅菌水5.6 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min； 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 靈敏度檢測(cè) 將鴨肉DNA模板稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍和108倍，以不同濃度DNA為模板，以10 μmol/L正向、反向引物檢測(cè)方法的靈敏度。反應(yīng)條件同1.2.3和1.2.4.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)束后，觀察擴(kuò)增曲線圖，讀取循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct 值)。若無(wú)典型擴(kuò)增曲線且Ct值大于30，判定檢測(cè)體系無(wú)非特異性擴(kuò)增。反之則認(rèn)為檢測(cè)體系有特異性擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體DNA COⅠ基因常規(guī)PCR特異性和靈敏度檢測(cè)結(jié)果

所提取的豬、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝、鴿和鵪鶉等9種動(dòng)物肌肉DNA模板濃度經(jīng)測(cè)定分別為157.67、141.46、206.52、178.7、174.57、198.24、115.61、191.43和125.62 ng/μL。以9種動(dòng)物DNA為模板，以鴨線粒體DNACOⅠ基因引物對(duì)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，鴨物種特異引物對(duì)僅對(duì)鴨肉DNA 模板特異擴(kuò)增出98 bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無(wú)擴(kuò)增。將鴨肉DNA模板按10倍梯度稀釋?zhuān)瑱z測(cè)方法的靈敏度，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可見(jiàn)，當(dāng)DNA模板稀釋103倍時(shí)，仍可明顯見(jiàn)到特異性條帶，靈敏度較高。

圖1 常規(guī)PCR特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Specificity test results of PCR

圖2 常規(guī)PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Sensitivity test results of PCR

2.2 線粒體DNA COⅠ基因熒光定量PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

以9種動(dòng)物肌肉DNA為模板，按照已優(yōu)化的條件進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)反應(yīng)體系的特異性，具體見(jiàn)圖3、表2。鴨引物只有與鴨DNA模板反應(yīng)才會(huì)有典型擴(kuò)增曲線，Ct值為24.37；其余反應(yīng)均無(wú)典型擴(kuò)增曲線，Ct值大于30或無(wú)，且無(wú)非特異性擴(kuò)增。

表2 不同動(dòng)物DNA模板獲得的Ct值Table 2 The Ct value of different animal DNA template

圖3 鴨引物擴(kuò)增曲線Fig.3 Amplification curve of duck primer

2.3 線粒體DNA COⅠ基因熒光定量PCR法靈敏度檢測(cè)

將鴨DNA模板按10倍梯度稀釋?zhuān)謩e采用0.03 μL和0.2 μL的引物體積，從DNA水平確定方法的檢測(cè)下限，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表3、圖4、圖5。可見(jiàn)，當(dāng)引物體積為0.03 μL時(shí)，既有典型擴(kuò)增曲線，Ct值又小于30的情況下，鴨DNA模板稀釋倍數(shù)達(dá)到102倍，即濃度達(dá)到1.98 ng/μL；當(dāng)引物體積為0.2 μL時(shí)，既有典型擴(kuò)增曲線，Ct值又小于30的情況下，鴨DNA模板稀釋倍數(shù)可達(dá)105倍，即濃度達(dá)到1.98 pg/μL。

表3 鴨DNA模板不同稀釋倍數(shù)獲得的Ct值Table 3 The Ct value of different dilution ratio of different animals DNA templates

圖4 0.03 μL鴨引物在鴨DNA模板不同稀釋倍數(shù)下的擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線從左到右稀釋倍數(shù)依次為稀釋10倍、102倍、103倍和104倍Fig.4 Amplification curve of different dilution ratio of 0.03 μL duck DNA primerFrom left to right of amplification curve, the dilutions were 10,102,103 and 104 times

圖5 0.2 μL鴨引物在鴨DNA模板不同稀釋倍數(shù)下的擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線從左到右稀釋倍數(shù)依次為10倍、102倍、103倍、104、105、106和107倍Fig.5 Amplification curve of different dilution ratio of 0.2 μL duck DNA primerFrom left to right of amplification curve, the dilutions were 10,102,103,104,105,106 and 107 times

3 討 論

目前，熒光定量PCR技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在食品肉類(lèi)成分源性鑒別方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，該技術(shù)一方面提升了定性檢測(cè)的準(zhǔn)確性，另一方面又使得定量檢測(cè)成為可能[17-18]，同時(shí)熒光定量PCR技術(shù)所需要的目標(biāo)片段較短，樣品基本不會(huì)受到加工工藝流程等方面的影響。而且隨著以線粒體DNA編碼基因差異為靶基因進(jìn)行的食品源性成分鑒定方法的不斷出現(xiàn)[12,19]，結(jié)合線粒體DNA和熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行肉與肉制品中動(dòng)物源性成分鑒別的研究技術(shù)已逐漸成熟。柳楠等[20]對(duì)線粒體16S rRNA引物進(jìn)行了改進(jìn)，成功檢測(cè)出近20種動(dòng)物源性成分，大大提高了檢測(cè)的特異性和效率。林彥星等[21]根據(jù)鴨mtDNACOX基因上的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立了畜禽肉與肉制品中鴨源性成分熒光定量PCR檢測(cè)方法。

線粒體DNACOⅠ基因位于細(xì)胞線粒體中，具有變異位點(diǎn)多、易被通用引物擴(kuò)增、序列很少存在插入和缺失等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用作DNA分類(lèi)的標(biāo)記基因[14,22]。梁瑞圓等[23]以山東小尾寒羊、洼地綿羊、蘇尼特羊、河北小尾寒羊和湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用COⅠ基因特定片段為靶基因，探討mtDNACOⅠ基因作為DNA條形碼鑒定不同綿羊品種和系統(tǒng)進(jìn)化的可行性。公月月等[24]基于線粒體COⅠ基因序列的特異性，構(gòu)建了18種觀賞魚(yú)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，建立了18種觀賞魚(yú)的品種鑒定方法。

目前該基因在畜禽肉與肉制品中動(dòng)物源性成分鑒別研究中報(bào)道甚少。本研究主要根據(jù)豬、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉等9種動(dòng)物線粒體DNACOⅠ基因差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)鴨特異性引物，并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)，觀察擴(kuò)增曲線和Ct值，對(duì)9種動(dòng)物畜禽肉進(jìn)行鴨源性成分鑒別，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)證明，所設(shè)計(jì)篩選的引物對(duì)只有在鴨模板DNA存在的情況下才會(huì)發(fā)生熒光PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生擴(kuò)增曲線和Ct值，而對(duì)其它8種動(dòng)物肌肉DNA模板無(wú)擴(kuò)增，成功建立了快速、準(zhǔn)確的基于線粒體DNACOⅠ基因的畜禽肉中鴨源性成分熒光PCR鑒別方法。研究結(jié)果為保障人們舌尖上的安全，打擊肉品市場(chǎng)摻假現(xiàn)象，維護(hù)市場(chǎng)秩序提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

線粒體DNACOⅠ基因可以用作畜禽肉中鴨源性成分鑒別的靶基因。根據(jù)本研究結(jié)果可見(jiàn)本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)篩選的特異性引物對(duì)以及所建立的熒光定量PCR方法可以準(zhǔn)確有效的進(jìn)行畜禽肉中鴨源性成分檢測(cè)。