前前腦-丘腦環(huán)路在全腦缺血期間低溫誘導(dǎo)的腦保護(hù)中的作用

王小華，聶彬彬，李燕虹，趙 菁，張 婷，王天龍，姜 偉

心臟驟停(CA)具有極高的死亡率及嚴(yán)重腦功能障礙后遺癥，并給公眾健康帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。在1985年-2018年期間，院內(nèi)心臟驟停(IHCA)后的1 y生存率較差，為13.4%。院外心臟驟停是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，生存率為13%，并且大多數(shù)幸存者患有永久性缺氧性腦損傷[1～3]。

近年來的研究證明，對(duì)CA后的造成的全腦缺血(GI)，低溫具有腦保護(hù)作用[4,5]，92%的患者在接受低溫治療后恢復(fù)到正?；蚪咏５纳窠?jīng)功能水平[6]。臨床結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，1例大型隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)得出結(jié)論，心肺復(fù)蘇后，32 ℃～34 ℃低溫減少恢復(fù)期腦功能障礙[7]。鑒于低溫在GI中的重要性，以往的研究已經(jīng)在相關(guān)的RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子水平研究了其潛在的腦保護(hù)機(jī)制[8]。在GI條件下,低溫也保護(hù)神經(jīng)元線粒體和神經(jīng)血管單位[19]。3項(xiàng)利用核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)大型試驗(yàn)表明，低溫降低了腦損傷的頻率和嚴(yán)重程度[10～12]。然而，到目前為止，低溫在腦網(wǎng)絡(luò)的功能和代謝活動(dòng)中的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。

在本研究中，我們使用18F-氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描(18F-FDG-PET)定量測(cè)定低溫及常溫全腦缺血后，低溫對(duì)不同腦區(qū)和節(jié)點(diǎn)的葡萄糖代謝的保護(hù)作用。此外，我們還利用擴(kuò)散張量成像(diffusion tense image,DTI)造影重建受低溫保護(hù)的腦白質(zhì)連接網(wǎng)絡(luò)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型 研究方案得到首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，按照法律和道德的動(dòng)物護(hù)理國(guó)際準(zhǔn)則，18只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(北京維塔爾河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào):SCXS2001-0017)，9～11 w齡，體重320～350 g，隨機(jī)分為3組。低溫GI組：(6只大鼠)建立GI模型的同時(shí)體溫維持在31 ℃～33 ℃。具體：將溫度探頭插入直腸，將大鼠放置在冷卻/溫?zé)崽荷?，將其連接到恒溫控制系統(tǒng)，通過反饋調(diào)節(jié)來保持溫度，在25 min的降溫期間，用酒精噴灑在大鼠的皮毛上，以降低體溫，低溫期維持期150 min，后大鼠復(fù)溫30 min，再保持正常溫度直至掃描。常溫GI組：(6只大鼠)采用相同系統(tǒng)的冷卻/溫毯建立GI模型，體溫始終維持在37 ℃～37.5 ℃，持續(xù)時(shí)間約為150 min。假手術(shù)組：(6只大鼠)維持在37 ℃～37.5 ℃，頸部正中切口，但不誘導(dǎo)GI模型(見圖1)。

圖1 記錄低溫全腦缺血(GI)組和常溫全腦缺血GI組的直腸溫度，反映全腦缺血模型過程中的體溫穩(wěn)定性

通過Longa技術(shù)行雙血管閉塞(2VO)構(gòu)建GI模型[13～15]。頸外靜脈插入導(dǎo)管抽血，左股動(dòng)脈進(jìn)行血壓監(jiān)測(cè)，右股動(dòng)脈進(jìn)行藥物輸注。頸部正中切口，雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)被分離并與下方放置結(jié)扎線。肝素(150 IU/kg)靜脈注射，通過頸靜脈導(dǎo)管抽血，維持40～50 mmHg的平均動(dòng)脈壓(mean blood pressure)MBP。在手術(shù)過程中，注意保留迷走神經(jīng)，測(cè)量血?dú)?，調(diào)整插管期間呼吸器的潮氣量，以達(dá)到動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)>90 mmHg，動(dòng)脈二氧化碳分壓(PaCO2)為35～45 mmHg，pH為7.35～7.45。結(jié)扎左側(cè)CCA 10 min后，結(jié)扎右側(cè)CCA，最終阻斷腦血流。共15 min后，緩慢通過頸靜脈導(dǎo)管回灌血液，注入0.5 ml碳酸氫鈉(0.6 M)。在135 min的恢復(fù)期后，傷口被縫合，大鼠被送回籠子。

1.218F-FDG-PET和DTIMRI數(shù)據(jù)采集 建立GI模型后24 h對(duì)大鼠進(jìn)行掃描。在18F-FDG注射前，所有大鼠都禁食12 h～15 h，但在任何時(shí)候都可以獲得飲用水。18F-FDG是從atom-hitech(HTA)技術(shù)有限公司(中國(guó)北京)(www.atom-hitech.com)獲得的。每只大鼠18F-FDG(體重18.5 MBq/100 g)經(jīng)尾靜脈注射，后大鼠被關(guān)在籠子里，并被放置在一個(gè)環(huán)境噪聲最小的房間中40 min，以攝取18F-FDG。腦內(nèi)18F-FDG攝取最大化的攝取周期為40 min。隨后，大鼠在掃描過程中使用鼻吸入異氟醚麻醉(100%氧氣中2% IsoFlo)(河北久木制藥有限公司，中國(guó))，并將塑料立體定向頭架放置在掃描儀床上的俯臥位置上。在動(dòng)物PET系統(tǒng)(中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所，E-plus260)上獲得18F-FDG-PET圖像，其徑向空間分辨率為1.55 mm全寬半最大值(FWHM)，位于視野中心(FOV)。在FDG-PET掃描過程中，大鼠大腦以FOV為中心進(jìn)行靜態(tài)采集10 min。然后利用有序子集期望最大化(4次迭代，12次子集)算法對(duì)圖像進(jìn)行重構(gòu)。在90×97×200矩陣上重建它們，體素大小為0.5×0.5和1 mm3。最后，所有掃描都以分析格式保存。使用7.0T動(dòng)物MRI掃描儀(70/16掃描，BrukerBiospinGmbH，德國(guó))獲得DTI數(shù)據(jù)，使用38毫米大鼠腦正交諧振器進(jìn)行射頻傳輸和接收。用回波平面成像序列[重復(fù)時(shí)間(TR)=12000 ms、回波時(shí)間(TE)=32.248 ms、矩陣大小163獲得DTI圖像=128×128×48，體素大小=0.35×0.35，0.56 mm，無片間隙]。沿30個(gè)獨(dú)立軸施加擴(kuò)散加權(quán)，b值為1000 s/mm2。獲得了5幅b值為0 s/mm2的參考圖像。最后，所有原始的Bruker圖像都被轉(zhuǎn)換為DICOM格式，軟件程序(Paravision 5.0)內(nèi)置在掃描儀。

1.318F-FDG-PET圖像分析 所有18F-FDG-PET圖像的數(shù)據(jù)分析在SPM8(Wellcome，認(rèn)知神經(jīng)學(xué)系，倫敦，英國(guó))的SpmratIHEP工具箱中進(jìn)行。首先，使用MRIcro手動(dòng)移除所有圖像的身體組織和背景，并在D3V重新定位圖像的來源，這與Paxinos & Watson空間中的標(biāo)準(zhǔn)18F-FDG-PET模板相對(duì)應(yīng)。然后，將單個(gè)大鼠腦圖像空間歸一化為Paxinos和Watson空間，將分析頭中的體素大小放大4倍，注冊(cè)到18F-FDG-PET模板，通過顱內(nèi)圖像去除顱外組織，剪切矩陣以切去背景。最后，將所有歸一化的18F-FDG-PET圖像用高斯核2×2×4 mm3FWHM平滑。進(jìn)一步體素統(tǒng)計(jì)分析，所有平滑的數(shù)據(jù)都是基于一般線性模型(GLM)框架的體素分析。為了確定18F-FDG信號(hào)的顯著性差異，使用SPM8進(jìn)行了檢測(cè)。采用基于無偏尺度因子的比例縮放和強(qiáng)度歸一化來解釋混雜因素。最后，根據(jù)體素水平的高度閾值P值<0.005，得到了具有顯著18F-FDG變化的腦區(qū)。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正在多個(gè)比較在集群級(jí)別進(jìn)行。通過基于體素的分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,每個(gè)束的內(nèi)部輪廓的調(diào)整也根據(jù)矢狀面和橫截面進(jìn)行解釋(大鼠大腦圖譜的立體定向坐標(biāo)，x軸對(duì)中線左側(cè)為負(fù)，對(duì)右側(cè)為正;y軸對(duì)腹方向相對(duì)于背側(cè)方向?yàn)檎?z軸對(duì)嗅球相對(duì)前囟為正，對(duì)小腦方向?yàn)樨?fù))。當(dāng)?shù)蜏谿I組或常溫GI組與假手術(shù)組比較時(shí)，如果18F-FDG攝取低于假手術(shù)組，并提示低代謝區(qū)(則顯示冷色藍(lán)色);如果18F-FDG攝取高于或等于假手術(shù)組，則提示高代謝區(qū)(顯示為暖色，橘紅及紅色);如果18F-FDG攝取等于假手術(shù)組，則提示等代謝區(qū)(顯示為灰色)。KE值表示集群的大小，即表示低體積區(qū)的體積。

1.4 MRIDTI圖像分析 所有DTI圖像在FSL(FMRIB軟件庫)(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)中進(jìn)行預(yù)處理。簡(jiǎn)單地說，使用FMRIB的擴(kuò)散工具箱在FSL中去除頭動(dòng)和渦流。然后計(jì)算每個(gè)單束的分?jǐn)?shù)各向異性(Flip angle)(FA)和平均擴(kuò)散率(Mean diffusion)(MD)。隨后，在SpmratI HEP工具箱(SPM8)中對(duì)FA和MD圖像進(jìn)行體素分析。簡(jiǎn)單地說，通過顱骨剝離和重新定位原點(diǎn)，對(duì)FA和MD數(shù)據(jù)集進(jìn)行了預(yù)處理。然后，將FA圖像空間歸一化為Paxinos & Watson空間中的FA模板圖像，并與MD圖像一起歸一化并進(jìn)行平滑。最后，基于GLM框架對(duì)所有平滑數(shù)據(jù)進(jìn)行體素分析，基于體素水平的高度閾值(P<0.005)對(duì)腦區(qū)進(jìn)行顯著FDG變化比較，并通過多重比較進(jìn)行FDR校正。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在SmraIHEP中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析如下：平均低溫GI組和常溫GI組的值，與假手術(shù)組進(jìn)行比較。顯著性水平定期設(shè)定為P<0.05。基于廣義線性模型。建立平滑平均歸一化攝取值18F-FDG-PET數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析模型，通過低溫GI組和常溫組建立兩個(gè)樣本t檢驗(yàn)分析。在KE中計(jì)算(Mn-UV)，對(duì)于聚類中的體素?cái)?shù)，它直接反映了區(qū)域的體積。Tmax值是每個(gè)集群中的最大t值，Tmax值>1表示差異顯著。峰值坐標(biāo)(mm)是Paxinos & Watson空間中最大點(diǎn)的坐標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 PET掃描分析結(jié)果顯示，低溫全腦缺血組和常溫全腦缺血組，腦中低代謝區(qū)域的差異 在PET掃描中的偽彩色方格顯示了低溫/常溫GI組與假手術(shù)組相比，在顯著不同的區(qū)域的FDG攝取變化顯示(見圖2A、B)中。低代謝區(qū)域(藍(lán)色區(qū)域)反應(yīng)受損傷區(qū)域，與低溫GI組相比，常溫GI組的大鼠腦中低代謝區(qū)域明顯范圍更大(見圖2A、B)。

圖2 與低溫全腦缺血組相比，常溫全腦缺血組的低代謝區(qū)明顯增大。冷偽色(藍(lán)色)表示相對(duì)于假手術(shù)組的低代謝區(qū)域，而暖偽色(橘色)則表示相對(duì)于假手術(shù)組的高代謝區(qū)域。(A)常溫全腦缺血組冠狀切面；(B)低溫全腦缺血組的冠狀切面

我們進(jìn)一步分析了低溫保護(hù)區(qū)域的分布情況，我們發(fā)現(xiàn)低溫全腦缺血組，前腦和丘腦的相對(duì)保存完好。此外，低溫全腦缺血組GI組丘腦區(qū)低代謝區(qū)較常溫全腦缺血組GI組明顯縮小(見圖3A、B)。與常溫GI組相比，低溫GI組在前前腦皮質(zhì)(PFC)和丘腦(Ts)也有的低代謝區(qū)明顯較小(見圖3A、B)。這些結(jié)果提示，全腦缺血條件下低溫有選擇性的保護(hù)前前腦(皮質(zhì))和丘腦(皮質(zhì)下部分)。

圖3 低溫GI組丘腦(Ts)區(qū)低代謝區(qū)(藍(lán)色區(qū)域)較常溫GI組明顯消失。前前腦皮質(zhì)(PFC)和感覺皮質(zhì)(SC)的低代謝區(qū)(藍(lán)色區(qū)域)在低溫GI組也明顯較小。冷偽色(藍(lán)色區(qū)域)表示相對(duì)于假手術(shù)組同腦區(qū)的低代謝區(qū)域，而暖偽色(紅色區(qū)域)則表示相對(duì)于假手術(shù)組高代謝區(qū)域。(A)常溫GI組的冠狀切面;(B)低溫GI組的冠狀切面;(C)常溫GI組的矢狀面;(D)低溫GI組的矢狀面。前前腦皮質(zhì)：PFC；Ts丘腦；SC感覺皮質(zhì)

同時(shí)，體素分析的精確數(shù)據(jù)結(jié)果顯示(見表1)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果的定量信息列于表1，其中“KE”表示每個(gè)簇中的體素?cái)?shù)，即KE數(shù)代表具有顯著低代謝的特定區(qū)域的體積。Tmax表示每個(gè)集群中的最大t值。Ts丘腦區(qū)是前前腦丘腦中間環(huán)路的中心，在低溫GI組與常溫GI組相比明顯縮小。常溫GI組丘腦區(qū)(Ts區(qū))KE=2391(Tmax=6.1129)，低溫GI組KE=342(Tmax=5.8853)(見表1)。PFC是前前腦-丘腦環(huán)路中一個(gè)非常重要的區(qū)域，低溫GI組與常溫GI組相比，PFC區(qū)的低代謝區(qū)域(藍(lán)色區(qū)域)也明顯縮小。常溫GI組PFC區(qū)KE值=553(Tmax=4.2414)。在低溫GI組中，KE值=71(Tmax=6.8144)(見表1)。在低溫GI組中，前前腦環(huán)路關(guān)鍵性節(jié)點(diǎn)結(jié)構(gòu)的保存，這表明與低溫參與此區(qū)域的細(xì)胞的保護(hù)。

表1 在低溫全球缺血組和常溫全球缺血組中，簇大小代表簇內(nèi)體素?cái)?shù)的KE值。兩組之間的兩個(gè)樣本t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 MRI T2結(jié)果分析顯示與低溫全腦缺血組相比，常溫全腦缺血損傷丘腦區(qū)損傷明顯 從MRI T2可以看出，在低溫全腦缺血組中幾乎觀察不到直接的腦損傷表現(xiàn)，而常溫全腦缺血組損傷明顯。而損傷區(qū)域的差異，集中在丘腦區(qū)域。

2.3 DTI結(jié)果分析顯示，低溫全腦缺血與常溫全腦缺血白質(zhì)纖維結(jié)連上的差異 從DTI結(jié)果來看，所有白質(zhì)纖維都在皮質(zhì)下和皮質(zhì)結(jié)構(gòu)之間進(jìn)行了跟蹤(見表2)。白質(zhì)纖維中的各向異性(FA)值高提示白質(zhì)纖維的保存完好。前前腦-丘腦環(huán)路的主要連接白色纖維是內(nèi)囊(IC)和胼胝體(CC)，它們FA在低溫GI組較高，與常溫GI組比較，F(xiàn)A-IC(分別為0.458±0.058和0.710±0.159)；FA-CC(分別為0.384、0.01和0.408±0.051；P<0.01和P<0.05)。FMI、MLF和SM也是前腦丘腦中間回路的結(jié)締組織纖維。胼胝體(FMI)[(0.928±0.071)vs(0.696±0.121)；P<0.05]、內(nèi)側(cè)縱束(MLF)[(0.894±0.050)vs 2560.661，0.131；P<0.05]和丘腦中紋(SM)[0.405，0.209，(0.225±0.064)；P<0.05]。在低溫的保護(hù)下，前前腦-丘腦環(huán)路白質(zhì)纖維的功能/結(jié)構(gòu)損傷明顯降低(見表2)。

表2 基于FA值的中間電路中白質(zhì)束的詳細(xì)信息

圖4 常溫全腦缺血組與低溫全腦缺血組，在MRI T2圖像上的腦損傷差異。常溫全腦缺血組丘腦區(qū)有明顯的損傷。(A)常溫全腦缺血組;(B)低溫全腦缺血組

3 討 論

我們的研究發(fā)現(xiàn)低溫GI組與常溫GI組相比，前前腦-丘腦環(huán)路神經(jīng)元代謝活性和連接組織纖維明顯保留。理論上，全腦缺血應(yīng)當(dāng)在所有腦區(qū)產(chǎn)生相對(duì)均勻的細(xì)胞損傷，然而，我們發(fā)現(xiàn)低溫在特殊的神經(jīng)元群體和不同的腦區(qū)對(duì)缺血產(chǎn)生分級(jí)和差異性保護(hù)。本研究發(fā)現(xiàn)低溫GI組低代謝區(qū)相對(duì)較低。在低溫GI組中，前前腦神經(jīng)元代謝活性得到了顯著的保留，如18F-FDG-PET發(fā)現(xiàn)所示。低溫可選擇性地保留丘腦和PFC的代謝激活。此外，MRI結(jié)果也支持了這一觀察，在DTI中，F(xiàn)A還顯示了CC和IC的保存，這是前前腦-丘腦環(huán)路纖維連接。在我們的研究中，PFC、丘腦和相關(guān)連接被低溫顯著保存，被確定為前腦丘腦中間回路的關(guān)鍵成分[16]。前前腦-丘腦環(huán)路被選擇性地保留，表明該環(huán)路在低溫保護(hù)中起著關(guān)鍵作用。前前腦-丘腦環(huán)路是維持正常意識(shí)、喚醒和睡眠覺醒的核心環(huán)路[17]。此環(huán)路在從具有潛在保留意識(shí)的昏迷中恢復(fù)中起著關(guān)鍵作用，也為中樞丘腦作為喚醒神經(jīng)調(diào)節(jié)的特殊節(jié)點(diǎn)提供了概念基礎(chǔ)[18]。

總之，低溫選擇性地保護(hù)了整個(gè)大腦中的特殊連接節(jié)點(diǎn)和功能和代謝大腦活動(dòng)中的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。在GI期間，整個(gè)大腦的血液供應(yīng)明顯減少，然而，在低溫治療后，前前腦-丘腦環(huán)路的關(guān)鍵部位被保留下來?；?8F-FDG-PET和DTI-MRI的發(fā)現(xiàn)，我們證明了在GI過程中低溫保存前前腦-丘腦環(huán)路。前前腦-丘腦環(huán)路可能發(fā)展成為全腦缺血患者治療的有力和潛在靶點(diǎn)，為嚴(yán)重癱瘓患者提供福音和希望。

4 致 謝

PET在中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所北京放射技術(shù)與設(shè)備工程研究中心進(jìn)行。作者感謝彭程對(duì)PET分析的幫助。作者還感謝薛景泉和楊文江進(jìn)行PET掃描。