免疫膠體金技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院（300300）孫利偉

免疫膠體金技術(shù)是氯金酸在還原劑作用下聚合成金顆粒，由靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，即膠體金，以此作為示蹤標(biāo)志物用于抗原抗體的免疫標(biāo)記技術(shù)[1]。膠體金自1971年作為免疫標(biāo)記物被Faulk和Taylor引入免疫化學(xué)，1989年后免疫膠體金快速檢驗(yàn)技術(shù)得到快速發(fā)展[2]。免疫膠體金技術(shù)不需使用特殊設(shè)備、儀器，成本低，無特殊環(huán)境要求，且所有反應(yīng)均能在15min內(nèi)完善，可適應(yīng)多種檢測(cè)條件，便于現(xiàn)場(chǎng)、基層使用，在激素、病毒、細(xì)菌、微生物、血清標(biāo)志物等檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)就其基本原理、制備方法、應(yīng)用情況等進(jìn)行一一介紹。

1 免疫膠體金技術(shù)的基本原理

免疫膠體金技術(shù)主要利用金顆粒的高電子密度特性，在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，能夠與蛋白質(zhì)分子正電荷基團(tuán)形成牢固結(jié)合，于顯微鏡下能見到黑褐色的顆粒狀，當(dāng)標(biāo)記物大量聚集時(shí)，肉眼即可見粉紅或紅色斑點(diǎn)。同時(shí)膠體金與蛋白質(zhì)分子之間的結(jié)合為靜電結(jié)合，不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)生物特性造成影響，穩(wěn)定性較高。根據(jù)膠體金的高電子密度、形狀、顆粒大小、顏色反應(yīng)等物理性狀，以及生物學(xué)特性，不僅能與蛋白質(zhì)結(jié)合，還可與免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、毒素、糖蛋白、酶、激素等結(jié)合，并能夠根據(jù)膠體金的大小展現(xiàn)出不同顏色，廣泛地應(yīng)用于病理學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)等領(lǐng)域。

2 制備方法

2.1 膠體金顆粒制備 根據(jù)選擇的還原劑不同，可制備出不同大小的膠體金顆粒，常用制備方法主要包括鞣酸-枸櫞酸鈉還原法和枸櫞酸三鈉還原法。鞣酸-枸櫞酸鈉還原法主要用于5nm直徑的膠體金顆粒制備。枸櫞酸三鈉還原法則可根據(jù)制備過程中枸櫞酸三鈉水溶液加入量、煮沸時(shí)間的不同獲得不同大小的膠體金顆粒，主要包括10nm、15nm、18nm、20nm、30nm、50nm等不同直徑的膠體金顆粒。制備過程中應(yīng)徹底清洗所需使用的玻璃器皿，最好經(jīng)硅化處理，以免影響活化后金顆粒或金顆粒與生物大分子結(jié)合的穩(wěn)定性。配置所使用的還原劑質(zhì)量要求上乘，試劑配置保持嚴(yán)格純凈，以最大程度避免混入雜質(zhì)，保障膠體金制備質(zhì)量。

2.2 蛋白制備 膠體金對(duì)蛋白的吸附作用與pH值相關(guān)，若蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)高于膠體金pH值時(shí)，則會(huì)失去結(jié)合能力，故蛋白質(zhì)的分子量會(huì)對(duì)膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合造成明顯影響。在待標(biāo)記蛋白溶液準(zhǔn)備時(shí)需根據(jù)標(biāo)記蛋白需求調(diào)節(jié)膠體金pH值，并在結(jié)合過程中加入一定量穩(wěn)定劑，以防膠體金與抗體蛋白聚合發(fā)生沉淀。膠體金標(biāo)記蛋白純化包括凝膠過濾法和超速離心法，凝膠過濾法主要用于以血清蛋白作穩(wěn)定的膠體金蛋白結(jié)合物的純化，超速離心法可根據(jù)不同大小的膠體金顆粒選擇不同的離心速度和離心時(shí)間。純化處理后可根據(jù)膠體金顆粒平均直徑測(cè)量及膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定進(jìn)行膠體金蛋白結(jié)合物質(zhì)量測(cè)定，以保障膠體金蛋白結(jié)合物制備質(zhì)量。

3 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)

由于膠體金作為標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便，敏感性、特異性高，無需使用放射性同位素或酶顯色底物，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，還可應(yīng)用于各種液相、固相免疫分析，以及流式細(xì)胞術(shù)等。液相免疫測(cè)定是將膠體金與抗體結(jié)合，建立微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的抗原。膠體金固相免疫測(cè)定主要是將斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與膠體金相結(jié)合，將膠體金標(biāo)記作為第二抗體，通過金顆粒聚集反應(yīng)形成肉眼可見斑點(diǎn)，便于臨床觀察。金標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)則是利用膠體金改變紅色激光散射角，達(dá)到放大散射角的目的，且不會(huì)影響細(xì)胞活性。此外，膠體金與熒光素共同使用時(shí)彼此之間互不干擾，效果穩(wěn)定。

4 臨床應(yīng)用

4.1 定性檢測(cè) 定性檢測(cè)是臨床檢測(cè)方法的一種，主要通過檢測(cè)某種抗體、抗炎是否存在，判斷是否有疾病。目前應(yīng)用于定性檢測(cè)的主要為斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法和膠體金免疫層析法，兩種檢測(cè)方法均具有操作簡(jiǎn)單、快速、抗基質(zhì)干擾強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。秦偉濤[3]研究發(fā)現(xiàn)，采用膠體金免疫層析法檢測(cè)人血清中EB病毒衣殼抗原IgA抗體，穩(wěn)定性好，特異性、敏感性極高，均超過90%。唐嘉等[4]研究發(fā)現(xiàn)，采用膠體金免疫層析法定性試紙條測(cè)定人體糞便中血紅蛋白，有助于提升人體糞便潛血檢出率，便于消化系統(tǒng)疾病的早期診斷，敏感性高。

4.2 半定量及定量檢測(cè) 膠體金本身就具有顏色，且根據(jù)制備出膠體金顆粒大小呈現(xiàn)出的顏色也各有差異。臨床采用光學(xué)傳感器或肉眼，可根據(jù)顏色的深淺變化進(jìn)行半定量、定量分析。

4.2.1 半定量檢測(cè) 半定量檢測(cè)是介于定性與定量之間的檢測(cè)，主要是根據(jù)電泳圖估計(jì)參照亮度一致前提下確定目標(biāo)基因的表達(dá)，檢測(cè)速度較快，多應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、血藥濃度測(cè)定等不太追求成分準(zhǔn)確含量的檢測(cè)中。任劉麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)，基于膠體金免疫競(jìng)爭(zhēng)法的原理制備拉莫三嗪?jiǎn)慰寺】贵w，以膠體金進(jìn)行抗體標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)對(duì)拉莫三嗪血藥濃度的半定量快速檢測(cè)，且效率高、成本低，廣泛適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)。宋興興等[6]研究結(jié)果顯示，采用葛根素膠體金試紙，以半定量限為34μg/ml評(píng)價(jià)葛根藥材質(zhì)量，檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高，說明免疫膠體金技術(shù)在原料中藥采購快速檢驗(yàn)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

4.2.2 定量檢測(cè) 定量檢測(cè)是測(cè)定物質(zhì)中相關(guān)組分含量，在各種病理診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。隨著免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展、完善，膠體金免疫定量檢測(cè)儀的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)建立一種新型快速定量檢測(cè)方法。免疫膠體金快速定量檢測(cè)主要是基于硝酸纖維素膜上檢測(cè)線顏色深淺變化與檢測(cè)物濃度呈一定關(guān)系，可將光學(xué)傳感器掃描結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)比，進(jìn)而得到定量分析結(jié)果。膠體金定量檢測(cè)試紙條顯色屬于動(dòng)態(tài)變化過程，試紙工藝、待測(cè)樣本差異性及檢測(cè)時(shí)環(huán)境均可對(duì)顯色結(jié)果造成影響，需做好質(zhì)量控制。同時(shí)采用檢測(cè)線/標(biāo)準(zhǔn)曲線比值進(jìn)行定量分析也可在一定程度上控制溫度、樣本等對(duì)顯色的影響。張?zhí)m蘭等[7]研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)抗人妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)單抗細(xì)胞株篩選配對(duì)抗體后，建立免疫膠體金快速定量檢測(cè)方法，與人甲胎蛋白、人胎盤催乳素、人泌乳素、人絨毛膜促性腺激素等不存在交叉，為產(chǎn)前診斷提高診斷率。免疫膠體金技術(shù)定量檢驗(yàn)在新冠肺炎快速檢測(cè)中也發(fā)揮較良好效果。寧樂平等[8]以核酸檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩種膠體金免疫層析技術(shù)試劑在新型冠狀病毒定量檢測(cè)診斷中的敏感度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均超過95%，可作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充。免疫膠體金技術(shù)定量檢測(cè)不僅可用病理、生理指標(biāo)測(cè)定，還可用于藥物成分、毒藥殘留量等測(cè)定中。李耀磊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，膠體金免疫層析技術(shù)在中藥材中對(duì)黃曲霉毒素B1定量檢測(cè)性能較好，在中藥材質(zhì)量、毒性評(píng)價(jià)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

4.3 多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè) 多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)在同時(shí)進(jìn)行多種成分檢測(cè)，能夠節(jié)省成本、時(shí)間，是未來臨床檢驗(yàn)的發(fā)展方向。黎明等[10]研究結(jié)果顯示，采用免疫膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)，在早期糖尿病腎病診斷中的準(zhǔn)確性較單一檢測(cè)更高。岳曉紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，膠體金法、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)、酶聯(lián)免疫法在兒童肺炎支原體感染檢測(cè)診斷中具有較高的診斷價(jià)值，各種方法之間是一種互相補(bǔ)充關(guān)系，聯(lián)合診斷準(zhǔn)確性更高。

5 小結(jié)

免疫膠體金技術(shù)作為一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，較免疫熒光技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)、放射免疫技術(shù)更加快捷、方便，適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，免疫膠體金技術(shù)定量分析儀則提升該技術(shù)臨床診斷的準(zhǔn)確性。但免疫膠體金技術(shù)較其他檢測(cè)方法靈敏度、陽性檢出率等存在一定差異。同時(shí)膠體金免疫定量檢測(cè)儀則會(huì)受到檢測(cè)環(huán)境、待檢物質(zhì)差異性等的干擾，存在明顯局限性。但隨著免疫膠體金技術(shù)持續(xù)發(fā)展，臨床可根據(jù)該技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀持續(xù)完善膠體金制備體系，建立更加科學(xué)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，研發(fā)更高效、高質(zhì)量的免疫膠體金技術(shù)定量分析儀，應(yīng)用前景較好。