轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)視角下頭頸癌人源性腫瘤異種移植瘤模型隊(duì)列的研究愿景

張志愿 孫樹(shù)洋

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面-頭頸腫瘤科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011

頭頸癌是全球第七大惡性腫瘤，局部晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性頭頸癌患者占比超過(guò)60%，其頜面部病變顯著影響患者咀嚼、吞咽等功能和生存質(zhì)量。近20 年來(lái)隨著顯微外科技術(shù)、分子靶向治療和免疫治療的創(chuàng)新發(fā)展，臨床中晚期的頭頸癌患者生存率有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但仍有相當(dāng)部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，乃至死亡?，F(xiàn)存多種治療策略無(wú)法滿足大部分患者的臨床獲益需求。如何深入理解頭頸癌的遺傳特征和發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為臨床患者尋求精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代下的個(gè)體化治療策略，是當(dāng)前廣大臨床醫(yī)生和科研人員亟待解決的難題。

1 頭頸癌輔助治療策略面臨多重困境

由于頭頸部解剖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和特殊性，晚期頭頸癌往往廣泛侵犯顱底、頸動(dòng)脈等重要解剖結(jié)構(gòu)。雖然外科術(shù)式的發(fā)展已經(jīng)顯著改善大量晚期頭頸癌患者的臨床預(yù)后，但是頭頸癌輔助策略仍然進(jìn)展緩慢，缺乏新療法的范式轉(zhuǎn)變。多項(xiàng)關(guān)于頭頸癌的臨床研究提示了頭頸癌輔助治療策略匱乏，缺乏有效生物標(biāo)志物的現(xiàn)狀：西妥昔單抗是目前美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network，NCCN） 指南中頭頸癌一線治療靶向藥物，但在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌中，西妥昔單抗單藥治療應(yīng)答率僅為13%；西妥昔單抗聯(lián)合同步放化療治療晚期頭頸鱗癌的研究提示該方案無(wú)法為患者帶來(lái)生存獲益，且表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達(dá)與藥效沒(méi)有相關(guān)性[1-2]；基于KEYNOTE-048的臨床研究結(jié)果，帕博利珠單抗單藥治療或帕博利珠單抗、鉑類和5-氟尿嘧啶聯(lián)合療法已納入復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移頭頸癌一線治療方案，但是帕博利珠單抗單藥或聯(lián)合用藥可能會(huì)出現(xiàn)腫瘤超進(jìn)展，整體中位生存期提升仍然相對(duì)較小[3]。

一項(xiàng)整合了28個(gè)國(guó)外臨床試驗(yàn)（合計(jì)4 189例頭頸鱗癌患者） 的Meta分析結(jié)果提示，多西他賽、順鉑和5-氟尿嘧啶（TPF） 誘導(dǎo)化療方案無(wú)法為口腔鱗癌患者帶來(lái)生存獲益[4]。為了研究該結(jié)論是否同樣適用于中國(guó)人群，筆者研究團(tuán)隊(duì)在科技部“十一五” 支撐計(jì)劃的支持下于2010年完成了全國(guó)首個(gè)口腔鱗癌誘導(dǎo)化療Ⅲ期臨床試驗(yàn)[5]。研究結(jié)果表明，TPF誘導(dǎo)化療同樣不能提高局部口腔鱗癌的生存率，但發(fā)現(xiàn)了部分預(yù)測(cè)TPF 誘導(dǎo)化療療效的潛在標(biāo)志物，如CCND1、GDF15 和ANXA1。雖然該研究已取得了一些成果，但是仍然存在著納入樣本量不足、且是單中心研究的局限性。為了克服上述問(wèn)題，筆者研究團(tuán)隊(duì)正在開(kāi)展國(guó)家口腔疾病臨床研究多中心項(xiàng)目局部晚期口腔鱗癌臨床試驗(yàn)，以進(jìn)一步明確TPF誘導(dǎo)化療在局部晚期可切除口腔鱗癌中的作用，并且挖掘潛在的生物標(biāo)志物。

臨床試驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^展現(xiàn)頭頸癌患者的治療響應(yīng)，同時(shí)也顯露出其治療局限性。聯(lián)合用藥已成為頭頸癌治療中常見(jiàn)治療策略，難以實(shí)現(xiàn)在臨床試驗(yàn)中評(píng)估單藥臨床療效。此外，不同解剖部位的頭頸腫瘤從基因到表型上差異顯著，借助臨床試驗(yàn)無(wú)法從分子層面深入挖掘腫瘤間和腫瘤內(nèi)遺傳多樣性，尤其是治療中出現(xiàn)腫瘤耐藥或超進(jìn)展時(shí)，僅依靠臨床試驗(yàn)難以闡明驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制。因此，腫瘤治療急需理想的臨床前模型模擬人類腫瘤的遺傳學(xué)和生物學(xué)特征，以期揭開(kāi)腫瘤發(fā)展和耐藥的神秘面紗，探尋有效的個(gè)體化治療策略。

2 PDX模型作為理想的臨床前研究工具

臨床前腫瘤模型包括人源性腫瘤異種移植瘤（patient-derived xenografts，PDX） 模型、人源性腫瘤來(lái)源細(xì)胞系（patient-derived cell lines，PDC）模型和人源性腫瘤來(lái)源類器官（patient-derived organoids，PDO） 模型。其中，PDX 模型是將患者腫瘤組織接種至免疫缺陷小鼠，使得患者腫瘤組織繼續(xù)在免疫缺陷小鼠上生長(zhǎng)，通過(guò)序列傳代構(gòu)建遺傳信息和組織學(xué)特征明確的移植瘤模型，是公認(rèn)的理想的臨床前藥物篩選工具[6]。

早在20 世紀(jì)60 年代Pygaard 和Povlsen 將原發(fā)性結(jié)腸腺癌接種至裸鼠皮下，成功構(gòu)建了世界上首例異種移植瘤模型[7]。70 年代中晚期，PDX 模型受到多次傳代丟失原發(fā)腫瘤特性的質(zhì)疑[8-10]，但是，通過(guò)對(duì)比異種移植瘤模型和臨床患者對(duì)相同化療方案的響應(yīng)差異，發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)高度相似性[11-13]。70 年代至90 年代，由于體外人類腫瘤細(xì)胞系的成功建立，逐漸興起了基于體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系的異種移植（cell line-derived xenografts，CDX） 模型，這種培養(yǎng)模式簡(jiǎn)單易行，腫瘤生長(zhǎng)速率穩(wěn)定[14-15]。但是，隨后研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞系和CDX模型在生長(zhǎng)過(guò)程中已經(jīng)適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境，造成了不可逆的生物學(xué)特性改變，顯著丟失了腫瘤關(guān)鍵遺傳特征和腫瘤異質(zhì)性[16-18]。由于上述局限性，PDX 模型在21 世紀(jì)初得以復(fù)興并廣泛應(yīng)用于癌癥臨床前研究[19-22]。

PDX 模型含有患者來(lái)源的多種腫瘤相關(guān)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞群體，并保存了腫瘤進(jìn)展過(guò)程中腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境交流的信息。在傳代早期，PDX 模型可以較好地保持人源性的基質(zhì)成分和免疫相關(guān)細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)增長(zhǎng)，鼠源性的基質(zhì)逐步替代腫瘤中的人源性基質(zhì)[23]。因此，在構(gòu)建PDX 模型的過(guò)程中至關(guān)重要的一點(diǎn)就是PDX 模型的穩(wěn)定性評(píng)估，只有通過(guò)生物信息學(xué)分析PDX 模型的突變狀態(tài)、拷貝數(shù)改變、基因表達(dá)和組織形態(tài)與患者腫瘤具有高度一致性，PDX 模型才算成功構(gòu)建。值得注意的是，不同惡性程度的腫瘤在構(gòu)建PDX 模型時(shí)具有不同的轉(zhuǎn)歸。成功建模的肺腺癌PDX 模型中與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因上調(diào)并伴隨EGFR的突變，這一情況與腫瘤的較差的預(yù)后相關(guān)[24]。相較于原發(fā)腫瘤，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織更易于構(gòu)建PDX 模型，筆者研究團(tuán)隊(duì)在構(gòu)建頭頸癌PDX模型過(guò)程中也得出類似結(jié)論[25-26]。此外，傳代過(guò)程中PDX 模型腫瘤細(xì)胞豐度不斷增加，經(jīng)過(guò)純化后的腫瘤細(xì)胞比原代腫瘤具有更高的PDC 模型構(gòu)建成功率。近幾年，筆者團(tuán)隊(duì)的孫樹(shù)洋研究員已經(jīng)完成涵蓋患者來(lái)源的PDX 模型、PDC 模型及免疫系統(tǒng)人源性化PDX 模型等千余例個(gè)體化模型的建立和遺傳學(xué)鑒定，搭建了全球最具規(guī)模的頭頸部腫瘤藥物個(gè)性化評(píng)估平臺(tái)。

3 PDX模型精準(zhǔn)反映腫瘤特征和克隆進(jìn)化

腫瘤可被視為多種異質(zhì)性克隆亞簇的集合，而攜帶不同遺傳和表觀遺傳變異的克隆亞簇是耐藥發(fā)生的重要因素[27]。由于基因組不穩(wěn)定性和腫瘤微環(huán)境的選擇壓力，腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的克隆亞簇存在時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)演進(jìn)，促使優(yōu)勢(shì)克隆亞簇群體富集。PDX 模型可在數(shù)次傳代擴(kuò)增中穩(wěn)定保持患者腫瘤的遺傳特征和克隆進(jìn)化過(guò)程。如頭頸鱗癌中TP53、NOTCH1 等抑癌基因高頻突變，通過(guò)檢測(cè)頭頸鱗癌PDX 模型和臨床患者的基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)二者具有高度一致性[28]。在其他腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌及其PDX 模型中也得出類似結(jié)論[29-30]。對(duì)乳腺癌原發(fā)腫瘤、腦轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)腫瘤來(lái)源的PDX 模型進(jìn)行基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)腫瘤來(lái)源的PDX 模型在保留原發(fā)腫瘤的基因突變基礎(chǔ)上同時(shí)也富集了腦轉(zhuǎn)移灶的基因突變，這也表明PDX 模型具有模擬腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)克隆亞簇改變的能力[31]。

盡管Ben-David 等[32]曾提出小鼠特異性選擇壓力導(dǎo)致PDX 模型存在有別于原發(fā)腫瘤的克隆進(jìn)化方向，這引發(fā)了PDX 模式是否能夠作為有效的臨床前驗(yàn)證模型的擔(dān)憂。但是，隨后1 451例PDX模型和509例患者腫瘤的拷貝數(shù)變異分析結(jié)果很快解除了該質(zhì)疑：Woo 等[33]發(fā)現(xiàn)傳代過(guò)程中PDX 模型會(huì)產(chǎn)生少量隨機(jī)突變，但是其并未涉及腫瘤相關(guān)驅(qū)動(dòng)突變，PDX 模型仍然能夠穩(wěn)定且真實(shí)地體現(xiàn)臨床患者的遺傳學(xué)信息，并呈現(xiàn)高度相似的腫瘤進(jìn)化改變。此外，目前已明確人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV） 感染不僅驅(qū)動(dòng)超過(guò)90% 的宮頸癌發(fā)病，同時(shí)也與口咽癌的發(fā)生具有高度相關(guān)性。對(duì)于HPV 陽(yáng)性口咽癌，PDX 模型能夠有效保留病毒活性和轉(zhuǎn)錄表達(dá)，為深入探究病毒感染影響口咽癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和治療響應(yīng)差異提供理想的體內(nèi)研究模型[28,34]。

4 PDX模型助力挖掘腫瘤個(gè)性化治療策略

4.1 評(píng)估藥物敏感性差異

在抗癌藥物研發(fā)的過(guò)程中，約90% 臨床前模型中具有活性的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)后未表現(xiàn)出相應(yīng)的有效性，究其原因是缺乏真實(shí)反映腫瘤遺傳學(xué)多樣性和腫瘤— 藥物互作的臨床前模型[35]。PDX 模型可作為反饋藥物敏感性的臨床前篩選平臺(tái)，有效助力新藥研發(fā)和 “老藥新用”。多個(gè)PDX模型組成充分涵蓋腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的治療隊(duì)列，能夠復(fù)制患者的基因組和生物學(xué)行為映射至PDX 模型，能夠從群體層面呈現(xiàn)臨床患者治療敏感性差異。此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，PDX 模型可在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)多階段取材，結(jié)合生物信息注解下的組學(xué)數(shù)據(jù)，有效挖掘藥物敏感性生物標(biāo)志物，并揭示潛在的藥物敏感及耐藥機(jī)制。諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)PDX 模型和PDX 來(lái)源的PDC 模型能夠有效模擬群體水平臨床患者的藥物治療響應(yīng)：Hallin 等[36]使用KRASG12C抑制劑MRTX849 篩選KRASG12CPDX模型和細(xì)胞系中的藥物敏感性差異， 并揭示MRTX849作用下不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)敏感PDX 模型的轉(zhuǎn)錄表達(dá)富集通路；Bruna 等[37]構(gòu)建了83 例乳腺癌PDX模型，對(duì)其中22例PDX來(lái)源的PDC模型進(jìn)行高通量藥物篩選，并進(jìn)一步在PDX 模型隊(duì)列中驗(yàn)證其中40種化合物的體內(nèi)藥效響應(yīng)。

考慮到臨床研究往往基于聯(lián)合用藥策略進(jìn)行設(shè)計(jì)，PDX 模型還具有評(píng)估個(gè)體間單藥治療藥效差異的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。2015 年，諾華生物醫(yī)學(xué)研究所納入了約1 000 例PDX 模型開(kāi)展高通量藥物篩選，首次提出了 “1×1×1” 理論，即1個(gè)患者1只小鼠1種藥物開(kāi)展臨床替代性試驗(yàn)[20]。該研究揭示了多種全新藥物治療策略，如BRAF抑制劑康奈菲尼與CDK4/6 抑制劑LEE011 聯(lián)用較單藥治療顯著延長(zhǎng)小鼠的無(wú)進(jìn)展生存期，并延緩耐藥發(fā)生。筆者課題組也借助 “1×1×1” PDX模型開(kāi)展了多項(xiàng)臨床替代性試驗(yàn)：孫樹(shù)洋研究員在CDK4擴(kuò)增的黏膜惡性黑色素瘤PDX 隊(duì)列開(kāi)展藥敏試驗(yàn)，使用mRECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估藥效響應(yīng)，揭示CDK4擴(kuò)增可作為預(yù)測(cè)帕博西尼（Palbociclib） 藥物敏感性的生物標(biāo)志物；此外，利用黏膜惡性黑色素瘤PDX 隊(duì)列，筆者課題組發(fā)現(xiàn)帕納替尼（Ponatinib） 較伊馬替尼（Imatinib） 對(duì)酪氨酸激酶受體c-kit V560D、K642E 和D816V 突變黏膜惡性黑色素瘤患者具有更高敏感性[38-39]。

4.2 推進(jìn)開(kāi)展同期臨床試驗(yàn)

基于頭頸癌缺乏分子分型指導(dǎo)的靶向治療現(xiàn)狀，開(kāi)展PDX 模型進(jìn)行同期臨床試驗(yàn)，將助力頭頸癌的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。根據(jù)患者遺傳學(xué)特征及靶向藥物預(yù)測(cè)性標(biāo)志物分型標(biāo)準(zhǔn)，在PDX 模型樣本庫(kù)中進(jìn)行模型匹配和對(duì)應(yīng)，進(jìn)而在PDX 模型中開(kāi)展與臨床試驗(yàn)治療一致的PDX 模型同期臨床試驗(yàn)[6]。同期臨床試驗(yàn)的原則是，對(duì)于原發(fā)耐藥模型，將其對(duì)應(yīng)患者剔除，而對(duì)于藥物敏感的PDX模型則持續(xù)治療，當(dāng)PDX 模型出現(xiàn)繼發(fā)耐藥，分析鑒定耐藥機(jī)制并制定和評(píng)估聯(lián)合用藥方案。由于PDX 小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)周期更短，當(dāng)PDX 模型對(duì)應(yīng)臨床患者出現(xiàn)耐藥，通過(guò)耐藥組織活檢樣本與PDX 耐藥模型匹配，根據(jù)模型藥效評(píng)估結(jié)果輔助臨床聯(lián)合用藥方案的制定。該實(shí)驗(yàn)方案可以短時(shí)間內(nèi)獲得遺傳學(xué)特征明確的 “患者”，開(kāi)展小鼠的臨床Ⅱ期試驗(yàn)，為后續(xù)臨床患者的聯(lián)合用藥策略提供有效參考。同時(shí)，也為頭頸癌以外其他腫瘤提供理想的替代模型。

4.3 發(fā)展人源性PDX模型

PDX 模型小鼠在多次傳代后會(huì)逐漸喪失人源性免疫細(xì)胞，因此無(wú)法深入研究免疫微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展中所發(fā)揮的作用。隨著腫瘤免疫治療的不斷發(fā)展，建立人異種移植腫瘤且具有人源化免疫系統(tǒng)的動(dòng)物模型可以在動(dòng)物體內(nèi)盡可能真實(shí)地反映腫瘤和免疫系統(tǒng)的相互作用，并可以應(yīng)用于腫瘤免疫藥物的篩選及其抗腫瘤機(jī)制的研究。在動(dòng)物體內(nèi)建立人源性PDX 模型比較常見(jiàn)的方式主要分為人造血干細(xì)胞移植腫瘤模型和人源性化外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 小鼠模型，其中，人源性化PBMC小鼠腫瘤模型是現(xiàn)階段較為成熟的一種技術(shù)。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)將健康成人外周血單核細(xì)胞注射至免疫缺陷的小鼠體內(nèi)繼續(xù)增殖和分化，從而在小鼠體內(nèi)重建人的以T細(xì)胞為主的人源免疫細(xì)胞。利用這一類動(dòng)物模型建立的PDX 腫瘤模型既具有人源性腫瘤的特征，又獲得了人源性免疫細(xì)胞的相關(guān)特征，可進(jìn)行T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)抗體類藥物和腫瘤疫苗等腫瘤免疫治療藥物的臨床前研究[40]。

考慮到通過(guò)PBMC 建立的人源性PDX 涉及了人免疫系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)的功能重建過(guò)程，還涉及了異體/異種排斥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)等諸多問(wèn)題。目前也進(jìn)行了許多進(jìn)一步的人源性小鼠腫瘤模型的嘗試，如通過(guò)將人源CD34+造血干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，在小鼠體內(nèi)分化出免疫細(xì)胞，獲得人免疫系統(tǒng)重建的小鼠，進(jìn)而建立人源性造血干細(xì)胞小鼠腫瘤模型[41-42]。通過(guò)此種方式建立的人源免疫細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育和成熟，可以較為有效地避免移植物抗宿主反應(yīng)，便于開(kāi)展長(zhǎng)期研究。筆者所在的研究團(tuán)隊(duì)已成功建立了基于PBMC 的頭頸部惡性腫瘤PDX 人源性模型，并開(kāi)展了部分腫瘤免疫藥物的篩選工作。

5 結(jié)語(yǔ)及展望

隨著多組學(xué)和生物信息分析技術(shù)的進(jìn)步，腫瘤研究闊步邁向個(gè)體化醫(yī)療時(shí)代。PDX 模型在覆蓋患者間和患者內(nèi)腫瘤異質(zhì)性的基礎(chǔ)上，為實(shí)現(xiàn)以精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)為核心的個(gè)性化治療方案提供臨床前模型參考。這種為患者 “量身定做” 的模型盡可能復(fù)制腫瘤的特征，能夠從分子層面重新認(rèn)識(shí)腫瘤的本質(zhì)和發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為在臨床前評(píng)估藥效，發(fā)現(xiàn)腫瘤生物標(biāo)志物和耐藥機(jī)制，進(jìn)一步研究藥物聯(lián)用策略提供了有效的研究平臺(tái)。由于PDX 模型不可避免地喪失了患者腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的互相作用，除重建人源化PDX 模型之外，原代腫瘤還可以通過(guò)構(gòu)建PDO 模型在體外重塑腫瘤微環(huán)境。PDO 模型所需時(shí)間相對(duì)較短，且基質(zhì)膠包裹腫瘤細(xì)胞可提供模擬體內(nèi)生存狀態(tài)的三維培養(yǎng)環(huán)境，為探究免疫相關(guān)腫瘤研究提供了另一理想模型。此外，包括EurOPDX 在內(nèi)的諸多PDX 模型庫(kù)中，HPV 相關(guān)頭頸癌等病毒性模型數(shù)量仍然相對(duì)較少。未來(lái)，立足于豐富的樣本資源，擴(kuò)大該類極具特色的頭頸腫瘤PDX 模型建立，同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)各個(gè)PDX 模型庫(kù)共同合作，納入大規(guī)模人群隊(duì)列開(kāi)展無(wú)偏移的臨床前研究需要所有科研人員的共同努力。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。