牽張成骨過程中相關(guān)細(xì)胞因子作用的研究

黃鵬程，王新衛(wèi)

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，洛陽研究生培養(yǎng)工作部，河南 鄭州 450000；2.洛陽正骨醫(yī)院，河南 洛陽 471000)

0 引言

牽張成骨(distraction osteogenesis，DO)首先用于人體四肢延長(zhǎng)手術(shù)。主要是采用一種拉伸裝置，從截骨處施加一定的張力，使骨缺損區(qū)細(xì)胞的增生合成功能激活，達(dá)到促進(jìn)組織再生的目的，促使骨骼伸長(zhǎng)。20 世紀(jì)50 年代，Ilizarov 提出了“張力應(yīng)激”規(guī)則，開創(chuàng)了牽張成骨的新時(shí)代，使骨延長(zhǎng)廣泛應(yīng)用于外傷治療骨缺損和創(chuàng)傷引起的肢體延伸。主要特征是一系列的細(xì)胞分子生物學(xué)變化，適當(dāng)?shù)臋C(jī)械牽張外力的刺激導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最后，組織趨向愈合，其間涉及到各種細(xì)胞：間充質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。在此期間，間質(zhì)細(xì)胞被復(fù)蘇、定向，并通過外力同源擴(kuò)張，然后分化成骨形成細(xì)胞，這是新骨再生的關(guān)鍵。

考慮到牽張成骨過程中易發(fā)生感染、關(guān)節(jié)攣縮、成骨不佳、肌肉萎縮等風(fēng)險(xiǎn)[1]，存在治療周期過長(zhǎng)的問題，作者對(duì)牽張成骨過程中的細(xì)胞因子相關(guān)作用進(jìn)行了綜述，以期從中找出最佳解決方案，具體綜述如下。

1 相關(guān)細(xì)胞因子

1.1 骨形成蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMPs)

BMP 屬于TGF-β 超家族的一分子，最早在20 世紀(jì)60 年代被發(fā)現(xiàn)，并由Urist 在誘導(dǎo)異位成骨的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了探索。它與許多骨生長(zhǎng)因子中的骨誘導(dǎo)最密切相關(guān)。在骨骼肌肉生長(zhǎng)過程中能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSc)分化，促使其向成骨細(xì)胞表達(dá)[2]，加速骨成熟與礦化。

眾多研究中，以BMP2、4、7 的研究最為常見。

1.1.1 BMP-2

BMP-2 是最重要的骨形成調(diào)節(jié)劑，在BMP 系統(tǒng)中它處于核心，不論在體內(nèi)外都對(duì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化和骨形成具備誘導(dǎo)作用。

Chalmers 等[3]認(rèn)為在骨與組織缺損區(qū)發(fā)生骨誘導(dǎo)的前提條件，必須存在三種情況：誘導(dǎo)劑；成骨前體細(xì)胞；合適的成骨環(huán)境。據(jù)此，我們有理由推測(cè)，在持續(xù)規(guī)律的機(jī)械牽拉刺激作用下，缺損區(qū)骨與軟組織發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)BMP 強(qiáng)烈表達(dá)，BMP 相關(guān)受體靶細(xì)胞作用于間充質(zhì)類細(xì)胞或成骨前體細(xì)胞，促使細(xì)胞分化，在血供豐富的環(huán)境中，與其他細(xì)胞生長(zhǎng)因子相互作用，加快骨組織再生修復(fù)。Raida 等[4]研究發(fā)現(xiàn)BMP- 2可能作為內(nèi)皮祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)之間的橋梁，銜接二者之間，促進(jìn)骨再生。Mizumoto 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)小鼠股骨缺損區(qū)局部注射BMP-2，不僅對(duì)于新骨生成具有加速作用，它還可以增加骨密度并改善新骨的生物力學(xué)特性。

1.1.2 BMP-4

BMP-4 在BMPs 中的作用與BMP-2 一樣突出。BMP-4參與誘導(dǎo)成骨過程主要是通過牽拉刺激下的自身強(qiáng)烈表達(dá)來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞的成骨分化[6]，它主要在軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)激烈，并激活堿性磷酸酶來促進(jìn)骨鈣素表達(dá)合成，進(jìn)而增加礦化性骨小節(jié)的形成，以此來刺激骨的生長(zhǎng)。

Pregizer 等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)BMP-4 的轉(zhuǎn)錄在骨成熟后的骨骼重塑期間保持高度活化，表明BMP-4 對(duì)于骨發(fā)育和體內(nèi)平衡是必需的。Miao Yu 等[8]在報(bào)告早發(fā)性骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松癥患者BMP-4 突變存在的研究中發(fā)現(xiàn)BMP-4 可能參與人類牙齒發(fā)育和骨骼穩(wěn)態(tài)。

1.1.3 BMP-7

BMP-7 類似BMP-2，有強(qiáng)大的誘導(dǎo)骨骼能力，它能夠保持軟骨細(xì)胞表型，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增生以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和II 型膠原合成[9]。有學(xué)者[10]認(rèn)為BMP-7 在牽張成骨中作用過程是通過將骨折周圍血腫內(nèi)未分化的MSCs 向軟骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，然后經(jīng)過鈣質(zhì)沉積生成新骨來實(shí)現(xiàn)的。

廖家成等[11]認(rèn)為BMP- 7 誘導(dǎo)成骨的作用主要是通過誘導(dǎo)骨膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，BMP-7 對(duì)誘導(dǎo)骨膜細(xì)胞增強(qiáng)堿性磷酸酶表達(dá)有突出貢獻(xiàn)，而成骨細(xì)胞可以分泌含有眾多堿性磷酸酶的基質(zhì)小泡，隨著基質(zhì)小泡的破裂，局部堿性磷酸酶濃度升高，形成磷酸鈣鹽，最終促進(jìn)鈣化成骨。

1.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)

VEGF 是一種同源二聚體糖蛋白，它主要分6 部分：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE 和 其 他。VEGF在牽張成骨中對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞作用較大，并且正常VEGF 水平是維持正常骨重建所必需的[12]。在骨修復(fù)的炎癥階段增加的炎癥因子，如前列腺素E1 和E2、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)，也誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)[13]。VEGF 充當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原的角色，在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，也對(duì)血管生成有誘導(dǎo)作用。血管和骨細(xì)胞之間的實(shí)時(shí)通信能夠確保細(xì)胞之間保持物理接近和功能依賴性[14]。

有學(xué)者[15]在大鼠牽張成骨模型中研究牽張成骨技術(shù)對(duì)骨骼形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)牽拉中期牽張力刺激下產(chǎn)生的內(nèi)源性VEGF 能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，VEGF 水平因應(yīng)用牽張運(yùn)動(dòng)而增加，與增強(qiáng)骨骼形成密切相關(guān)。Han 等[16]研究發(fā)現(xiàn)VEGF 和MSCs 作用密切，MSCs 在缺血肢體中可通過分泌VEGF，將其作用于內(nèi)皮細(xì)胞，或直接參與血管再生。此外研究發(fā)現(xiàn)隨著牽張力的增加，牽張外力的刺激可促進(jìn)VEGF 以及bFGF 的生成，這表明二者對(duì)血管神經(jīng)的新生成具有促進(jìn)作用，在缺損區(qū)血管生成部位不足的情況下，應(yīng)用VEGF 不失為一種新的方法和思路。

1.3 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)

bFGF 以高度保守的單體肽的身份廣泛存在于人體組織中，對(duì)胚胎發(fā)育、骨及軟骨的修復(fù)重建意義較大。而且作為一種促分裂素，bFGF 還能將不同種類的間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分裂表達(dá)，在骨折缺損早期它能夠在肉芽組織中高度表達(dá)，在創(chuàng)傷早期加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，促使組織自我修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，在牽拉成骨過程中，通過持續(xù)規(guī)律的牽拉刺激，bFGF 活性得到增強(qiáng)，在成骨細(xì)胞和干細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈，并能夠促使骨痂形成[17]。

Zhang 等[18]在兔下頜骨缺損研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF 基因轉(zhuǎn)染BMSCs 后表達(dá)增強(qiáng)，在兔下頜骨缺損模型中植入試驗(yàn)劑，結(jié)果表明與Bio-Oss 相關(guān)的bFGF 修飾的BMSCs 比傳統(tǒng)方法更有效地促進(jìn)新骨再生。Du 等[19]和Horikoshi-Ishihara 等[20]以及Ikeda 等[21]在研究中證實(shí)，bFGF 可明顯促進(jìn)干細(xì)胞增生，血管生成和神經(jīng)再生。

1.4 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (transforming growth factor , TGF-B)

作為一種蛋白質(zhì)多肽，在牽張成骨過程中，TGF-β 可以在牽引部位對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行趨化，并可以促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的有絲分裂，增進(jìn)軟骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞的增生，加速間充質(zhì)細(xì)胞的分化，增加細(xì)胞外蛋白質(zhì)和膠原蛋白的合成，抑制其降解。此外，高濃度的TGF-β 對(duì)促進(jìn)血管生成以及Ⅰ型膠原的合成作用突出?？傊?，TGF-β 在牽張成骨中的作用主要體現(xiàn)在：促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，加速成骨細(xì)胞的成熟，促進(jìn)骨再生。

TGF-β 在血小板和骨組織中含量豐富。其在人體只存在TGF-β 1、2、3 這三種，現(xiàn)在人們的主要關(guān)注點(diǎn)仍在TGF-β1方面。作為一種調(diào)節(jié)因子，TGF-β1 在骨折剛開始發(fā)生時(shí)，就能快速啟動(dòng)自我修復(fù)功能，通過促進(jìn)BMSc、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的增生表達(dá)，來促使成骨細(xì)胞的合成，以加速骨贅的增生，促進(jìn)骨折愈合[22]。Ueda A 等[23]在臨床研究中證實(shí)TGF-β1、2、3 都在成骨細(xì)胞上表達(dá)，與骨折愈合相關(guān)，且只有TGF-β2 在骨膜上表達(dá)顯示陽性，這充分表明了TGF-β2 的多效成骨的特點(diǎn)。

1.5 類胰島素樣生長(zhǎng)因子 (insulin-like growth factor , IGF)

在骨吸收過程中，骨基質(zhì)或破骨細(xì)胞釋放出幾種成骨因子，IGF 就是其中一員[24]。IGF 作為胰島素樣生長(zhǎng)因子，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)具有胰島素樣代謝效應(yīng)，目前有兩種表現(xiàn)形式，以IGF-1 研究較多。

王陽等[25]認(rèn)為IGF-1 在牽張成骨中主要作用于骨骺軟骨板，能加速骨的縱向生長(zhǎng)。另有學(xué)者認(rèn)為IGF-1 主要與其受體酪氨酸激酶聯(lián)合作用，上調(diào)蛋白激酶和c-Jun 氨基端激酶，與成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)相作用，促進(jìn)細(xì)胞增生分化，而且，IGF-1 可作為成骨細(xì)胞分化的頭號(hào)標(biāo)志物上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白以及堿性磷酸酶MSCs 基因表達(dá)[26]，其成骨作用可通過加速堿性磷酸酶活性表達(dá)來增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨。

目前，更多的研究結(jié)果表明，IGF-1 可以促進(jìn)牽張成骨過程中ALP 的活性，然而，作為外源性生長(zhǎng)因子，IGF-1 的使用還未成熟，需要進(jìn)一步探尋其發(fā)生發(fā)展機(jī)制[27]。

1.6 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)

SDF -1 屬于趨化因子蛋白家族，也稱趨化因子CXCL12，它以小分子細(xì)胞因子的身份在骨與組織中起作用。主要有兩種表現(xiàn)形式：SDF-1α/ CXCL12a；SDF-1β/ CXCL12 b。

SDF-1 在牽張成骨中的作用機(jī)制與骨折修復(fù)過程相像。牽拉刺激過程中，充質(zhì)干細(xì)胞表面能夠表達(dá)CXCR4，促使骨膜中SDF-1 表達(dá)増加，SDF-1 能特異性趨化CXCR4 表達(dá)陽性的MSCs，參與骨組織再生修復(fù)。周恩瑜等[28]在大鼠缺損模型中，通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，研究SDF-1 在牽張成骨新骨缺損中的表達(dá)及其對(duì)牽張成骨作用機(jī)制，初步研究結(jié)果示：隨著牽張的逐漸進(jìn)展，SDF-1 的表達(dá)在成骨細(xì)胞和微血管周圍逐漸增加，對(duì)照組骨折中骨贅的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。

1.7 神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (nerve growth factor , NGF)

NGF 在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族中位居首位，它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)都具備調(diào)控功能，是一種調(diào)節(jié)多種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的蛋白質(zhì)。

骨折修復(fù)重建過程中需要多方面協(xié)作參與，神經(jīng)生長(zhǎng)作為重要的一環(huán)，NGF 在骨折愈合中的作用顯得越發(fā)重要[29-30]。目前對(duì)于NGF 在牽拉成骨中的作用主要從促進(jìn)BMP-2 誘導(dǎo)成骨方面闡述。Chaoyong 等[31]認(rèn)為神經(jīng)纖維生長(zhǎng)與骨折愈合關(guān)系緊密，在牽張刺激下，NGF 能誘導(dǎo)缺損局部神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，使神經(jīng)肽類物質(zhì)局部釋放、局部血供增加，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞和骨愈合相關(guān)基因，促進(jìn)骨誘導(dǎo)。姚建華等[32]證實(shí)骨組織中有神經(jīng)纖維存在，驗(yàn)證了Chaoyong 等人的觀點(diǎn)。

有學(xué)者[33]在試驗(yàn)中將NGF 局部注射在在骨缺損斷端，隨后觀測(cè)結(jié)果顯示骨痂生成速度加快，質(zhì)量明顯增加，證實(shí)了NGF 在促進(jìn)骨折修復(fù)方面的突出作用。

1.8 金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase , MMPs)

牽張成骨過程中MMPs 的運(yùn)行機(jī)制尚未明確，國(guó)外研究顯示在骨與軟骨的重塑過程中，MMPs 通過破骨細(xì)胞聚集、成骨細(xì)胞存活促進(jìn)骨吸收和形成，因此，它們被作為反映骨再生和組織重塑早期生物標(biāo)志物[34]。

MMPs 通過分解ECM 成分，從細(xì)胞膜上脫落生物活性分子或蛋白質(zhì)修飾它們參與骨代謝和骨發(fā)生[35]。目前MMPs 研究最多的是MMP10。Reyes 等[36]在小鼠顱骨局部缺損模型研究中研究發(fā)現(xiàn)，MMP-10 在與BMP-2 聯(lián)合使用的情況下，可以加速骨愈合和提高礦化速率。

1.9 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase , NOS)

NOS 能夠以產(chǎn)生NO 或通過釋放生長(zhǎng)因子的方式來促進(jìn)骨折愈合。eNOS 和iNOS 隸屬于NOS 的三種異構(gòu)體之中的兩種。eNOS 大部分在細(xì)胞膜上表達(dá)，常見于血管內(nèi)皮細(xì)胞。iNOS 大部分在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，常見于炎癥細(xì)胞，如白細(xì)胞。eNOS 與iNOS 在牽張成骨過程中相互制約，i NOS 隨eNOS的減少而增加，兩者共同作用于骨形成和骨改建。iNOS 合成的眾多NO 對(duì)于成骨細(xì)胞增生有克制作用，而且還能夠引導(dǎo)其分解代謝，對(duì)破骨細(xì)胞機(jī)能有阻礙作用。

吳巍等[37]在兔下頜牙實(shí)驗(yàn)過程中，通過免疫組化檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：TGF-β1 在牽張成骨過程中對(duì)eNOS 起調(diào)控作用，成正相關(guān)，通過對(duì)eNOS 調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)對(duì)i NOS 的調(diào)控，i NOS 又通過調(diào)控NO 濃度對(duì)TGF-β1 產(chǎn)生反作用，進(jìn)而促進(jìn)新生骨生成，促使骨折創(chuàng)面愈合。

2 不足與展望

牽張成骨技術(shù)自臨床實(shí)際應(yīng)用以來，以其獨(dú)特的成骨理念和創(chuàng)新的手術(shù)方式受到了臨床醫(yī)師的一致推崇，其相關(guān)成骨理念直到現(xiàn)在仍然走在世界的前列，然而社會(huì)需要進(jìn)步，技術(shù)同樣需要革新，在科技社會(huì)日益發(fā)展的今天，醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展也在穩(wěn)步前進(jìn)，我們需要繼承發(fā)展，開拓創(chuàng)新。臨床實(shí)踐證實(shí)，骨缺損區(qū)骨、軟骨的生長(zhǎng)以及血管神經(jīng)的再生重建需要多種生物細(xì)胞因子參與，在單一的刺激下，僅能收到一定的效果，但卻缺乏顯而易見的臨床療效，我們有理由相信，在應(yīng)用多種細(xì)胞因子及合理載體前提下，打造完整的信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分子的有機(jī)重建，這才是骨再生成功的關(guān)鍵。