產(chǎn)香真菌GS-1菌株的生物學特性研究

王春生,智亞楠,趙付平,侯夢圓,陳利軍

(信陽農(nóng)林學院 農(nóng)學院，河南 信陽 464000)

一些真菌在生長過程中可以產(chǎn)生揮發(fā)性代謝物質(zhì)，主要由醇、苯、醛、烯烴、酸、酯、酮等物質(zhì)組成，這些真菌產(chǎn)生的各種含碳氣態(tài)化合物的混合物被稱作真菌揮發(fā)性物質(zhì)(volatile organic compounds，VOCs)[1]。由于這些揮發(fā)性物質(zhì)具有分子量小、易揮發(fā)、能在空氣和土壤中自由擴散、良好的細胞膜穿透性等特性[2-4]，在植物病害防控方面，能快速地擴大作用范圍，提高對靶標病原菌的抑制效果[4]。相對植物揮發(fā)性物質(zhì)，產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的真菌具有繁殖快、周期短、易培養(yǎng)、易改良、適應(yīng)性強、不受季節(jié)時令限制等優(yōu)點[5]，因此真菌VOCs作為重要的植物病害生防資源，成為近些年來國內(nèi)外研究的熱點之一[6-8]。

產(chǎn)香真菌GS-1菌株無性態(tài)為普通瘤座孢菌(Tubercularia vulgaris)，有性態(tài)為叢赤殼(Nectria cinnabarina)，其揮發(fā)性物質(zhì)香味濃郁，對多種植物病原真菌具有明顯的熏蒸抑制作用，對番茄果實灰霉病具有良好的生防效果，因此具有良好的生防潛能[3]。但目前對其生物學特性尚不清楚，限制了其揮發(fā)性物質(zhì)熏蒸抑菌功能的進一步研究。本研究通過測定不同培養(yǎng)條件下菌落直徑來分析溫度、pH值、碳源、氮源和培養(yǎng)基對GS-1菌株生長的影響，明確GS-1菌株的生物學特性，以期為GS-1菌株揮發(fā)物的進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

產(chǎn)香真菌GS-1菌株由信陽農(nóng)林學院植物病理實驗室分離并保存。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1000 mL。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉15 g、水1000 mL。

查氏培養(yǎng)基(CA)：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉15 g、水1000 ml。

麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：麥芽浸膏25 g、瓊脂粉15 g 水1000 ml。

水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：水1000 ml、瓊脂粉15 g。

燕麥片瓊脂(OMA)：燕麥片30 g、瓊脂粉15 g、水1000 ml。

1.3 產(chǎn)香真菌GS-1菌株的生物學特性研究

1.3.1 溫度對菌絲生長的影響 將GS-1菌株在PDA平皿培養(yǎng)5 d，用無菌打孔器在菌落邊緣取5 mm菌餅，接入新的PDA平皿中央，分別置于13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃，共6個溫度下黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.3.2 pH值對菌絲生長的影響 用1 mol/L的鹽酸(HCl)和1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液將PDA的pH值分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9和10，共設(shè)8個處理。接種GS-1菌株5 mm菌餅后，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.3.3 碳源對菌絲生長的影響 氮源以CA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、果糖代替蔗糖，另設(shè)無蔗糖(無碳源)處理。接種GS-1菌株5 mm菌餅后，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.3.4 氮源對菌絲生長的影響 以CA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的苯丙氨酸、半胱氨酸、蛋白胨、酵母浸膏代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉，另設(shè)無硝酸鈉(無氮源)處理。接種GS-1菌株5 mm菌餅后，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.3.5 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 將GS-1菌株5 mm菌餅分別接種至PDA、PSA、CA、WA、OMA和MEA培養(yǎng)基上，22℃黑暗培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3皿，重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，應(yīng)用Duncan氏新復極差法進行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對GS-1菌株生長的影響

對不同溫度條件下培養(yǎng)5 d的GS-1菌株菌落直徑進行測量。從圖1可以看出，GS-1菌株在所試的13～28 ℃溫度范圍內(nèi)均能生長，在19～25 ℃的范圍內(nèi)均生長較好，其中22 ℃為最適生長溫度，且與其它所試溫度存在顯著差異。

圖1 溫度對GS-1菌株生長的影響(5 d) 圖2 pH值對GS-1菌株菌絲生長的影響(6d)

2.2 pH值對GS-1菌株生長的影響

不同pH值培養(yǎng)基對GS-1菌株生長影響的結(jié)果見圖2。產(chǎn)香真菌GS-1菌株在所試的pH值3～10的范圍內(nèi)均可生長，最適pH值范圍為4～7，第6 天菌落平均直徑分別為45.8、48.3、46.2 cm和45.0 cm，顯著大于其他pH值的處理。

2.3 碳源對GS-1菌株生長的影響

碳源對GS-1菌株生長影響的結(jié)果見圖3。GS-1菌株在所試的5種碳源和無糖(無碳源)培養(yǎng)基上均可生長，以葡萄糖為最佳碳源，菌落平均直徑與其它碳源處理存在顯著差異，第6 天的菌落平均直徑可達40.3 cm。GS-1菌株在以果糖、乳糖、蔗糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上也可較好地生長。

2.4 氮源對GS-1菌株生長的影響

圖3碳源對GS-1菌株生長的影響(6d)

從圖4看出，GS-1菌株在所試培養(yǎng)基上均可生長，酵母浸膏為最佳氮源，第6 天菌落平均直徑可達49.3 cm，與其它氮源處理存在顯著差異。GS-1菌株在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上也可較好地生長。

2.5 培養(yǎng)基對GS-1菌株生長的影響

GS-1菌株在供試的6種培養(yǎng)基上均能正常生長(圖5)，以PDA為最適培養(yǎng)基，第6 天的菌落平均直徑可達46.3 cm。在WA培養(yǎng)基上的菌落生長最慢，第5 天的平均直徑僅為8.7 cm。

圖4 氮源對GS-1菌株菌絲生長的影響(6 d) 圖5 不同培養(yǎng)基對GS-1菌株菌絲生長的影響(5 d)

3 討論

產(chǎn)香真菌GS-1菌株的揮發(fā)性物質(zhì)對植物病原真菌具有良好的生防效果，其揮發(fā)物是其生防功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。真菌揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生受培養(yǎng)條件的影響[9]，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，因此明確GS-1菌株的生物學特性，提供適宜GS-1菌株生長的培養(yǎng)條件，是研究其生防功能開發(fā)和利用的前提。

叢赤殼主要寄生于多種樹木的枝干，引起枝枯病、潰瘍病、珊瑚斑病等[10-12]。在叢赤殼屬(Nectria)分類研究中對叢赤殼的菌落生長情況進行了簡單的描述[13]，但未見有關(guān)其生物學特性的研究報道。本文研究了溫度、pH值、碳源、氮源、培養(yǎng)基等對GS-1菌株生長的影響，結(jié)果表明：產(chǎn)香真菌GS-1菌株在19～28 ℃的范圍內(nèi)均生長較好，最適生長溫度為22 ℃；最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母浸膏；最適宜的pH值范圍為4～7；以PDA為最適培養(yǎng)基，其次為PSA和OMA培養(yǎng)基。