鐵桿山藥多酚氧化酶純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

陳軍，蔣魯圓

(宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

鐵桿山藥(Dioscoreaopposita)是一種常見的蔬菜，其營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，具有很高的食用、保健及藥用價(jià)值[1-2]，但鐵桿山藥在貯藏或深加工過程中會(huì)有變褐的現(xiàn)象，在山藥受到損傷時(shí)，暴露出的果肉也會(huì)逐漸變黑，會(huì)影響其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、口感及其商業(yè)價(jià)值等。研究認(rèn)為：當(dāng)果蔬受到機(jī)械損傷時(shí)，多酚氧化酶就會(huì)從機(jī)體中釋放出來，與空氣中的氧分子接觸，通過氧化酚或多酚形成相對(duì)應(yīng)的醌，醌類物質(zhì)繼續(xù)發(fā)生聚合反應(yīng)，產(chǎn)生黑色化合物[3]。多酚氧化酶(PPO)廣泛存在于果蔬中，果蔬發(fā)生褐變主要是由組織中的三種物質(zhì)引起，既酚類物質(zhì)、氧氣和PPO[4-6]，因此，近年來一些學(xué)者對(duì)蔬菜中的PPO做了大量的研究。本研究采用勻漿提取法提取鐵桿山藥PPO，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)不同溫度、pH、底物、不同濃度的底物、抑制劑對(duì)PPO的影響以及PPO的熱穩(wěn)定性，進(jìn)而分析鐵桿山藥PPO的酶學(xué)性質(zhì)，為控制鐵桿山藥變褐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：鐵桿山藥(市售)，鄰苯二酚(兒茶酚)、L-絡(luò)氨酸、Vc、檸檬酸、EDTA、NaCl、焦性沒食子酸，均為分析純。

儀器：冷凍高速離心機(jī)(上海元析儀器有限公司)、紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵桿山藥PPO的粗提取 采用勻漿浸取法[7]，將0.2 mol/L的NaH2PO4與0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O按一定比例混合，配制磷酸鹽緩沖溶液，pH為6.8，洗凈鐵桿山藥，去皮，取2.0 g預(yù)冷的鐵桿山藥和15 mL磷酸鹽緩沖液于研缽中，研磨后置于4 ℃冰箱靜置10 min，取出上清液轉(zhuǎn)至10 mL離心管中，用高速冷凍離心機(jī)以4 ℃、5000 r/min離心20 min，將離心所得上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，收集的上清液即為鐵桿山藥PPO粗酶液，將其儲(chǔ)存至4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 鐵桿山藥PPO的酶活性測(cè)定 參照段勇[8]的實(shí)驗(yàn)方案，取4只試管，使用移液槍向試管中分別加入2 mL的磷酸緩沖液(pH=6.8)、1 mL的0.04 mol/L兒茶酚，以3只試管為平行試驗(yàn)，另外一只試管為空白對(duì)照組，平行實(shí)驗(yàn)組加入0.5 mL的新鮮酶液，空白對(duì)照組加入0.5 mL的蒸餾水。試管中加入酶液后，搖勻振蕩，在波長(zhǎng)為420 nm的紫外分光光光度計(jì)中測(cè)得吸光值，每30 s記一次吸光值，共5 min。

1.2.3 鐵桿山藥PPO的純化 采用硫酸銨分級(jí)沉淀法[9]，將(NH4)2SO4加入PPO粗酶液至30%的飽和度，5000 r/min的條件下的離心機(jī)離心20 min，棄上清液，向沉淀中加入不同pH值的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，并將(NH4)2SO4緩慢加入PPO粗酶液中使其飽和度達(dá)到50%，再次在高速冷凍離心機(jī)中4℃以5000 r/min離心20 min，根據(jù)溶液的體積加入(NH4)2SO4使其飽和度達(dá)到80%,再按上述步驟處理。

1.2.4 不同底物對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 將兒茶酚、L-絡(luò)氨酸和焦性沒食子酸3種不同底物均配制成濃度為0.04 mol/L的溶液。取3支試管，向每支試管中加入2 mL的pH=6.8磷酸鹽緩沖溶液和0.5 mL的新鮮酶液，分別加入1 mL 的0.04 mol/L濃度的底物，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光值，每組底物測(cè)量三次，取平均值，計(jì)算得到PPO酶活。

1.2.5 不同濃度兒茶酚對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 分別配制不同濃度的兒茶酚0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L，在試管中加入2 mL(pH=6.8)的磷酸緩沖液、1 mL 不同濃度的兒茶酚和0.5 mL的新鮮酶液，空白對(duì)照組加入0.5 mL的雙蒸水進(jìn)行對(duì)照，在相同環(huán)境下，每組底物測(cè)量三次，在波長(zhǎng)為420 nm處測(cè)得吸光值，取平均值，計(jì)算得到PPO酶活。

1.2.6 不同pH對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 將0.2 mol/L的NaH2PO4和0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O混合，配制成pH分別為5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7的磷酸緩沖液，在試管中分別加入不同pH的磷酸緩沖液2 mL、1 mL 0.04 mol/L的兒茶酚和0.5 mL的新鮮酶液，空白對(duì)照組加入0.5 mL的雙蒸水進(jìn)行對(duì)照，在波長(zhǎng)為420 nm處測(cè)得吸光值，得到PPO酶活。

1.2.7 不同溫度對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 將加有2mL的 pH=6.8的磷酸緩沖液和1mL的 0.04 mol/L的兒茶酚的試管，分別放入20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃中保溫5 min，再加入0.5 mL酶液，空白對(duì)照組加入0.5 mL的雙蒸水，在相同環(huán)境下，每組底物測(cè)量三次在波長(zhǎng)為420 nm處測(cè)得吸光值，計(jì)算得到PPO酶活。

1.2.8 不同抑制劑對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 在加有2 mL的pH=6.8磷酸緩沖液和1 mL的0.04 mol/L兒茶酚試管中，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%和1.8%的不同抑制劑檸檬酸、Vc、NaCl和EDTA各0.5 mL，再加入0.5 mL的新鮮酶液，空白對(duì)照組加入0.5 mL的雙蒸水進(jìn)行對(duì)照，在波長(zhǎng)為420 nm處測(cè)得吸光值，計(jì)算得到PPO酶活。

1.2.9 鐵桿山藥PPO熱穩(wěn)定性 將新鮮酶液放入100 ℃中，分別保存5、10、15、20、25、30、35 s，取1 mL酶液放入裝有2 mL的pH=6.8磷酸緩沖液和1 mL 的0.04 mol/L兒茶酚試管中，空白對(duì)照組加入0.5 mL的雙蒸水進(jìn)行對(duì)照，在相同環(huán)境下，每組底物測(cè)量三次，在波長(zhǎng)為420 nm處測(cè)得吸光值，取平均值，計(jì)算得到PPO酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同底物對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響

圖1 不同底物對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 圖2 不同濃度的兒茶酚對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影

由圖1可知，相同濃度的底物，其中兒茶酚對(duì)鐵桿山藥PPO的影響最大，其反應(yīng)過程中在420 nm處吸光值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于L-絡(luò)氨酸和焦性沒食子酸，并且隨著兒茶酚濃度的增加，PPO酶活力越強(qiáng)，在兒茶酚濃度為0.07 mol/L時(shí)，PPO酶活力達(dá)到最大；當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.03～0.05 mol/L之間時(shí)L-絡(luò)氨酸與焦性沒食子酸對(duì)鐵桿山藥PPO的影響相似，幾乎相同，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?.03 mol/L和高于0.05 mol/L時(shí)，L-絡(luò)氨酸的影響稍高于焦性沒食子酸的影響。由此表明，鐵桿山藥的最適底物為兒茶酚，此結(jié)果也與劉瑩、趙喜亭[10]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。

2.2 不同濃度的兒茶酚對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響

由圖2可知，隨著兒茶酚濃度增加，PPO活性先增大后減小。兒茶酚濃度在0.01～0.07 mol/L時(shí)，隨著底物濃度的增大，PPO活性逐漸增大；當(dāng)兒茶酚的濃度在0.07～0.09 mol/L時(shí)，隨著底物濃度的增大，PPO的活性逐漸減低。由此表明，鐵桿山藥的PPO的最適兒茶酚底物濃度為0.07 mol/L。

2.3 不同pH對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響

由圖3可知，pH為5.8～6.0時(shí)，鐵桿山藥PPO的活性在不斷增加，當(dāng)pH=6.0時(shí)，酶活性最強(qiáng)。PPO中含有Cu2+，PPO在較酸性環(huán)境中會(huì)使Cu2+分解，進(jìn)而使PPO失活，當(dāng)pH>6.0時(shí)，其酶活性逐漸下降，其原因是偏中性環(huán)境中，Cu2+會(huì)生成Cu(OH)2沉淀，而使PPO活性下降。由此表明，鐵桿山藥PPO的最適pH為6.0。

2.4 不同溫度對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響

由圖4可知，在20℃～30℃時(shí)，鐵桿山藥PPO的酶活性逐漸增強(qiáng)，在30℃時(shí)，鐵桿山藥PPO活性達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，鐵桿山藥PPO的活性又逐漸降低。由此表明，鐵桿山藥PPO的最適反應(yīng)溫度為30℃。

圖3 不同pH對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 圖4 不同溫度對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響

2.5 不同抑制劑對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響

由圖5可知，隨著抑制劑濃度的增加PPO活性逐漸降低。不同抑制劑對(duì)鐵桿山藥PPO活性的抑制效果有一定差異，Vc的抑制效果最好，EDTA的抑制效果次之，檸檬酸和NaCI的抑制效果相對(duì)較差。由于Vc是一種有機(jī)酸，具有一定的還原作用，能夠?qū)u2+轉(zhuǎn)化成Cu+，有效地抑制了PPO的活性。

2.6 鐵桿山藥PPO活性的熱穩(wěn)定性

由圖6可知，鐵桿山藥PPO在100℃中加熱，伴隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其吸光值不斷下降，使得鐵桿山藥PPO酶分子遭到破壞，酶活性持續(xù)降低，加熱30 s之后，PPO的酶活性基本失活。

圖5 不同抑制劑對(duì)鐵桿山藥PPO活性的影響 圖6 鐵桿山藥PPO活性的熱穩(wěn)定性

3 結(jié)論

鐵桿山藥是一種較受歡迎的蔬菜，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，對(duì)其PPO特性研究具有很高的應(yīng)用價(jià)值。通過研究得出，鐵桿山藥PPO最適底物為兒茶酚，其濃度為0.07 mol/L，最適溫度為30℃，最適pH為6.0，Vc對(duì)鐵桿山藥PPO活性的抑制效果最為顯著，鐵桿山藥PPO在100℃中加熱30 s后，其酶活性基本喪失。