CPB期間靜脈泵注Dex的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況、腦皮質(zhì)組織IL-6表達(dá)變化及其機(jī)制

張璐，謝玉波，陳燕樺，盧伊芝，何芳，梁蓓薇

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧 530021

體外循環(huán)(CPB)技術(shù)常用于臨床心內(nèi)直視手術(shù)，它的使用大大降低了心臟手術(shù)后患者心肌梗死、心力衰竭等心血管不良事件的發(fā)生率及其他心臟原因相關(guān)病死率[1]。然而研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，CPB會(huì)對(duì)心臟手術(shù)患者產(chǎn)生神經(jīng)損傷，術(shù)后患者常出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、譫妄、中風(fēng)等現(xiàn)象。右美托咪定(Dex)是一種能高度選擇性激動(dòng)α2腎上腺素能受體的新型藥物，具有一定地中樞抗交感、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，臨床上常被用做麻醉輔助劑。圍手術(shù)期間泵注Dex可顯著降低CPB心臟手術(shù)后患者出現(xiàn)中風(fēng)和譫妄的概率，且具有腦保護(hù)作用[4]。心臟手術(shù)患兒CPB期間可導(dǎo)致腦血流自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損，海馬神經(jīng)元凋亡及大量炎癥因子釋放，而Dex應(yīng)用于心臟手術(shù)能減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[5-6]，但關(guān)于其具體機(jī)制的研究尚少。Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腦損傷后細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和血管生成的基因表達(dá)[7]，抑制此通路可加速凋亡過程中神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)，減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，從而降低腦梗死的大小，改善神經(jīng)功能[8]。2019年9月—2020年3月，我們觀察了體外循環(huán)(CPB)期間靜脈泵注右美托咪定(Dex)的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況、腦皮質(zhì)組織IL-6表達(dá)變化，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年SPF級(jí)SD大鼠48只，體質(zhì)量300～350 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(桂)2016-0054]，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施完成[SYXK(桂)2016-0037]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[2016(KY-E-002)]，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義的關(guān)懷。

1.2 藥物、試劑及儀器 Dex(批號(hào)：15011032，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；IL-6 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)，TUNEL試劑盒(美國Roche公司)，BCA蛋白測(cè)定試劑盒(上海雙螺旋生物科技有限公司)，兔抗大鼠pJAK2、pSTAT3單克隆抗體(美國Abcam公司)，紅外標(biāo)記的二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，Western blot一抗、二抗稀釋液(上海碧云天生物科技研究所)；小動(dòng)物膜式氧合器(東莞科威公司)，體外循環(huán)機(jī)(德國Stockert公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、Dex給藥方法及CPB模型制備 48只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組各16只。①Dex組(D組)：在制模前10 min按照5 μg/kg的負(fù)荷劑量靜脈泵注Dex，后制備CPB模型，即大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，麻醉成功后將大鼠仰臥固定于操作臺(tái)上，運(yùn)用16 G靜脈套管針進(jìn)行經(jīng)口腔氣管插管，設(shè)置小動(dòng)物呼吸機(jī)參數(shù)(潮氣量3 mL/100 g，頻率60次/分)，進(jìn)行機(jī)械通氣。大鼠右側(cè)頸前區(qū)，左右腹股溝區(qū)常規(guī)剪毛、消毒，后分別行1 cm左右大小切口，用玻璃分針鈍性分離出大鼠右頸外靜脈，右股靜脈和左右股動(dòng)脈，行左股動(dòng)脈穿刺并置入24 G靜脈套管針，用作監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)動(dòng)脈血壓、血?dú)庾兓腿砀嗡鼗幚?，左?cè)股動(dòng)脈穿刺并置入24 G靜脈套管針，用作連接小動(dòng)物膜式氧合器出血端即CPB灌注端，右頸外靜脈穿刺并置入20 G靜脈套管針至右心房，右股靜脈穿刺并置入22 G靜脈套管針，將右頸外靜脈、右股靜脈聯(lián)合用作連接小動(dòng)物膜式氧合器入血端即CPB流出端，轉(zhuǎn)機(jī)開始前經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈注入肝素鈉500 U/kg，若ACT>480 s開始轉(zhuǎn)機(jī)，轉(zhuǎn)機(jī)開始后，流出端依靠30 cm左右的重力差引流血液至貯血器，通過滾軸泵入氧合器經(jīng)灌注端回輸，灌注量為100～120 mL/(kg·min)，大鼠平均動(dòng)脈血壓維持在75～100 mmHg，整個(gè)CPB環(huán)路無氣泡產(chǎn)生，即模型制備成功。若動(dòng)物模型制備不成功，則選取同種大鼠重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。制模后轉(zhuǎn)機(jī)2 h，轉(zhuǎn)流期間Dex以5 μg/(kg·h)的泵注速度維持。轉(zhuǎn)機(jī)2 h后停CPB。②體外循環(huán)組(C組)：建立大鼠CPB模型，模型制備方法參照“①”，制模后轉(zhuǎn)機(jī)2 h，轉(zhuǎn)流期間給予與D組等量生理鹽水。③假手術(shù)組(S組)：只作動(dòng)靜脈血管穿刺置管，不轉(zhuǎn)機(jī)，給予與D組等量生理鹽水。

1.4 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用TUNEL法。各組大鼠于CPB轉(zhuǎn)流2 h結(jié)束后立即隨機(jī)取8只，開胸，分離出心臟，剪開心尖部和右心耳，依次經(jīng)升主動(dòng)脈灌注100 mL生理鹽水和4 ℃、4%多聚甲醛，頸椎僵硬后立即剪斷頭部取出腦組織，快速于冰面上分離出海馬，放入4 ℃、4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋后，制成5 μm厚的冠狀切片。參照TUNEL試劑盒步驟進(jìn)行操作，取石蠟切片，依次經(jīng)脫蠟復(fù)水、蛋白酶消化、染色(TUNEL、DAB、蘇木素)、脫水、中性樹脂封片后，光鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色，且可見棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取海馬CA1區(qū)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 大鼠大腦皮質(zhì)組織勻漿上清液IL-6水平檢測(cè) 采用ELISA法。CPB轉(zhuǎn)流2 h結(jié)束后立即處死各組余下的8只大鼠，剪斷頭部，取出腦組織，快速的在冰面上分離出海馬和皮質(zhì)，海馬組織保存于-80 ℃冰箱中(用于下述實(shí)驗(yàn))，皮質(zhì)組織用勻漿器充分勻漿，后置于離心機(jī)，以3 000 r/min速度離心30 min，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)IL-6。

1.6 大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白檢測(cè) Western blot法。取“1.5”已制備并保存于-80 ℃冰箱中的海馬組織，加入RIPA裂解液和PMSF，使蛋白在冰上充分裂解40 min，后以12 000 r/min速度離心5 min，棄沉淀留上清液。按照BCA法進(jìn)行蛋白定量。分別制備12%分離膠和5%濃縮膠，取60 μg蛋白加入上樣緩沖液(與蛋白比例1∶4)，100 ℃變性后，點(diǎn)樣到SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，PVDF膜先用純甲醇浸泡后放入平衡液中，待電泳完畢后，采用半干法使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗，加入兔抗大鼠pJAK2單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠pSTAT3單克隆抗體(1∶1 000)和兔抗ACTB多克隆抗體(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗去除未結(jié)合的一抗。加入羊抗兔IgG抗體(1∶10 000)，室溫孵育2 h。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜，采用Imaga J軟件測(cè)定灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 D、C、S組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為3.93%±0.30%、14.40%±0.18%、3.11%±0.24%，D、S組分別與C組比較，P均<0.05。

2.2 各組大鼠大腦皮質(zhì)組織勻漿上清液IL-6水平比較 D、C、S組IL-6水平分別為(31.04±0.70)、(47.84±1.33)、(27.99±0.80)pg/100 mg，D、S組分別與C組比較，P均<0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 各組大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

CPB對(duì)全身灌注的內(nèi)臟器官產(chǎn)生負(fù)面影響，腦損傷是CPB的常見并發(fā)癥之一[9]。CPB相關(guān)腦損傷可能與炎癥反應(yīng)、腦灌注不足、栓塞等病理生理學(xué)機(jī)制有關(guān)，其中炎癥反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和在CPB所致腦損傷的發(fā)展過程中起重要作用，減輕細(xì)胞凋亡和抑制炎癥因子釋放對(duì)CPB期間腦保護(hù)有重要意義[10-11]。研究[12]表明，CPB是非生理性灌注，血液成分與非生物材料接觸引發(fā)炎癥反應(yīng)。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí)，Dex表現(xiàn)出一定地腦保護(hù)作用[13-14]。已有研究報(bào)道，Dex可緩解大鼠創(chuàng)傷性腦損傷，其機(jī)制可能與減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)有關(guān)[15]。WANG等[16]通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)Dex使腦缺血梗死面積明顯縮小，改善認(rèn)知記憶功能障礙以及提高腦缺血后存活率。另外研究證實(shí)，Dex的使用可減少異丙酚誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)，降低活化Caspase-3表達(dá)，減輕神經(jīng)毒性[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，D組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，大腦皮質(zhì)勻漿上清液IL-6水平降低，提示Dex對(duì)大鼠CPB腦損傷有保護(hù)作用。

JAK2/STAT3通路是一條細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其可與炎癥因子(如白細(xì)胞介素)間相互調(diào)節(jié)。JAK2通過磷酸化被激活，STAT3作為JAK2的下游因子在JAK2激活后發(fā)生磷酸化[18]。LI等[19]通過建立大鼠CPB循環(huán)模型，發(fā)現(xiàn)海馬組織pJAK2、pSTAT3表達(dá)上調(diào)，使用JAK2/STAT3通路特異性拮抗劑能改善CPB大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙。研究證實(shí)，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路能減輕腦缺血再灌注損傷所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與S組比較，C組大鼠海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；與C組比較，D組海馬組織pJAK2、pSTAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低；上述結(jié)果提示，Dex可能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活對(duì)CPB大鼠腦損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

總之，CPB期間靜脈泵注Dex可減輕大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦部炎癥，機(jī)制可能與其可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活有關(guān)。