鼻咽癌患者血清中長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5的表達(dá)變化及其意義

陳正魯，鐘宇南，戴秋芹，陳梓宏，余忠華，羅海清

1廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 524001；2廣東醫(yī)科大學(xué)

鼻咽癌是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病率具有顯著的區(qū)域性特點(diǎn)。全球范圍內(nèi)以東南亞及我國(guó)兩廣地區(qū)最為多見(jiàn)[1]。由于鼻咽腔狹小，組織結(jié)構(gòu)深藏，發(fā)病比較隱匿。文獻(xiàn)報(bào)道，臨床上70%鼻咽癌患者確診時(shí)已屬中晚期[2-3]。晚期鼻咽癌以系統(tǒng)化治療為主，患者預(yù)后較差。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是腫瘤相關(guān)的調(diào)控因子，調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(lncRNA-GAS5)是一種抑癌基因，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。lncRNA-GAS5在肝癌、大腸癌、卵巢癌等腫瘤中參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等調(diào)控過(guò)程，發(fā)揮抑癌作用[5-7]，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是目前有關(guān)lncRNA-GAS5在鼻咽癌中作用機(jī)制的報(bào)道較為罕見(jiàn)。我們前期研究[8]顯示，lncRNA-GAS5在鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，表明lncRNA-GAS5在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，但其在鼻咽癌血清學(xué)中的研究鮮有報(bào)道。2015年3月—2018年12月，我們觀察了鼻咽癌患者血清中l(wèi)ncRNA-GAS5的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月—2018年12月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的鼻咽癌患者56例，男36例，女20例；年齡17～72(48.01±6.01)歲，其中<60歲25例，≥60歲31例；TNM分期(2008年中國(guó)鼻咽癌分期版本)Ⅰ期11例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期12例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N0 27例，N1～N3 29例；腫瘤直徑<3 cm 35例，≥3 cm 21例；腫瘤分化程度為低分化26例，中分化12例，高分化18例；所有患者均經(jīng)活檢病理確診，且術(shù)前均未接受過(guò)任何放化療治療、靶向治療、免疫治療。另選同期健康體檢者42例，男27例，女15例；年齡18～68(45.23±5.68)歲；均無(wú)腫瘤史、家族史。本研究患者均知情并簽署知情同意書(shū)，另經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清lncRNA-GAS5檢測(cè) 取56例鼻咽癌患者和42例健康體檢者清晨外周靜脈血各5 mL，全血自凝4 h，后在常溫下以3 000 r/min的速度離心10 min，提取上清液，再在4 ℃下以12 000 r/min的速度離心10 min，提取血清，置于-80 ℃冰箱中保存，室溫解凍，后在4 ℃下以12 000 r/min速度離心10 min，吸取上清液200 μL，應(yīng)用miRNeasy Serum/Plasma Kit提取血清總RNA。利用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加州福斯特市Applied Biosystems)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，RT-PCR反應(yīng)在應(yīng)用生物系統(tǒng)7900快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)。反應(yīng)條件：模板預(yù)95 ℃、30 s，變性：94 ℃、15 s，退火及擴(kuò)增：60 ℃、30 s，共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)對(duì)照。用比較循環(huán)閾值(CT)計(jì)算lncRNA-GAS5的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌患者、健康志愿者血清lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量比較 鼻咽癌患者、健康志愿者血清lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量分別為3.69±1.33、7.13±1.93，兩者比較，P<0.05。

2.2 血清lncRNA-GAS5表達(dá)與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，血清lncRNA-GAS5表達(dá)與鼻咽癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

表1 血清lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 血清lncRNA-GAS5表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系 單因素分析顯示，lncRNA-GAS5表達(dá)水平[HR(95%CI)為13.792(6.244～30.465)，P<0.05]、腫瘤直徑[HR(95%CI)為0.533(0.294～0.967)，P<0.05]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[HR(95%CI)為0.262(0.134～0.514)，P<0.05]、TNM分期[HR(95%CI)0.102(0.048～0.216)，P<0.05]與鼻咽癌患者預(yù)后有關(guān)，性別[HR(95%CI)為0.715(0.381～1.343)，P>0.05]、年齡[HR(95%CI)為0.612(0.336～1.114)，P>0.05]、腫瘤分化程度[HR(95%CI)為1.107(0.621～1.971)，P>0.05]與鼻咽癌患者預(yù)后無(wú)關(guān)；多因素分析顯示，lncRNA-GAS5的低表達(dá)[HR(95%CI)為6.526(2.132～19.980)，P<0.05]、腫瘤直徑≥3 cm[HR(95%CI)為0.430(0.230～0.806)，P<0.05]與鼻咽癌患者不良預(yù)后有關(guān)。

2.4 血清lncRNA-GAS5表達(dá)與鼻咽癌患者生存的關(guān)系 隨訪(fǎng)時(shí)間截至2019年12月，患者隨訪(fǎng)時(shí)間10～69個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間39個(gè)月。Kaplan-Meier結(jié)果顯示，血清lncRNA-GAS5高表達(dá)者(高于lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量的均值,2例)及低表達(dá)者(低于lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量的均值，27例)患者總生存期分別為50.3、27.5個(gè)月，兩者比較，P<0.05。

3 討論

鼻咽癌是具有明顯地域分布特點(diǎn)的頭頸部腫瘤，全球以東亞和東南亞地區(qū)多見(jiàn)，我國(guó)以南部地區(qū)流行為主，其是一種發(fā)生于鼻咽黏膜的上皮性癌[9]。鼻咽癌主要病理類(lèi)型包括基底樣鱗狀上皮癌、角化性鱗狀上皮癌和非角化性鱗狀上皮癌。非角化性鱗狀上皮癌又可分為分化型和未分化型，其中未分化非角化性癌是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型。目前認(rèn)為，鼻咽癌發(fā)生可能與EBV感染、宿主遺傳學(xué)和環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素有關(guān)。鼻咽癌早期發(fā)病及癥狀比較隱蔽，大部分患者就診時(shí)已經(jīng)是中晚期，早期篩查、診斷、治療是鼻咽癌防治的重要策略之一。

近年大量研究表明，lncRNA與腫瘤的發(fā)病機(jī)制之間存在著密切關(guān)系。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA的表達(dá)改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。有研究結(jié)果表明，一些lncRNA也可以作為循環(huán)lncRNA在全身循環(huán)中被檢測(cè)出來(lái)，它們的表達(dá)可能與鼻咽癌患者的生理和病理改變直接相關(guān)[11]。lncRNA-GAS5為lncRNA分子中的其中一類(lèi)，其在癌癥組織和正常組織中的表達(dá)存在差異。lncRNA-GAS5可以通過(guò)一些信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用，其與多種腫瘤有顯著的相關(guān)性，包括前列腺癌[12]、乳腺癌[13]等，它在這些癌癥中可能起抑癌基因的作用。GEE等[14]發(fā)現(xiàn)，腫瘤中l(wèi)ncRNA-GAS5呈低表達(dá)，提示腫瘤患者預(yù)后不良。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清lncRNA-GAS5表達(dá)降低，其高表達(dá)通過(guò)滅活PI3K/AKT/mTOR途徑抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移。研究[16]發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血清lncRNA-GAS5中分離出外泌體(Exo-GAS5)，其在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)降低，表明Exo-GAS5可以作為理想的基于無(wú)創(chuàng)血清的標(biāo)記物，用于識(shí)別早期NSCLC患者，間接證明lncRNA-GAS5同樣可以用做識(shí)別早期NSCLC患者的血清標(biāo)志物。SHEN等[17]通過(guò)對(duì)比膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血清中l(wèi)ncRNA-GAS5的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)血清中l(wèi)ncRNA-GAS5低表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者比高表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存率差。LI等[18]認(rèn)為，大腸癌患者血清中l(wèi)ncRNA-GAS5顯著下調(diào)與細(xì)胞因子表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，lncRNA-GAS5通過(guò)抑制的細(xì)胞因子IL-10和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)抑制大腸癌的發(fā)展。lncRNA-GAS5除了上述的功能外，其還能充當(dāng)微小RNA(miRNA)的海綿競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性RNA，從而降低了miRNA的表達(dá)[19]。HE等[20]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-GAS5是微小RNA-21(miR-21)的上游調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)抑制部分miR-21調(diào)節(jié)腹主動(dòng)脈瘤的形成。因此，lncRNA-GAS5可作為防止腹主動(dòng)脈瘤形成的潛在靶點(diǎn)。研究[8]顯示，lncRNA-GAS5表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后相關(guān)。

本研究分析了lncRNA-GAS5在鼻咽癌血清中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。目前有關(guān)lncRNA-GAS5在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中的研究極少報(bào)道過(guò)。眾所周知，組織學(xué)檢查是癌癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可以通過(guò)鼻內(nèi)鏡活檢或手術(shù)切除獲得，但其缺點(diǎn)在于檢查有創(chuàng)及價(jià)格昂貴，并且具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床上尋找替代性的診斷技術(shù)是有必要的。血液作為生物流體的非侵入性腫瘤生物標(biāo)記物自然引起了極大的興趣。本研究顯示，鼻咽癌血清lncRNA-GAS5表達(dá)低于健康志愿者，lncRNA-GAS5表達(dá)與鼻咽癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這與之前課題組組織樣本的研究結(jié)果大體一致。另外，lncRNA-GAS5表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了鼻咽癌的的侵襲性進(jìn)展。Kaplan-Meier分析顯示，血清lncRNA-GAS5高表達(dá)患者的總生存期顯著高于低表達(dá)者，這與Shen等[22]報(bào)道的血清lncRNA-GAS5在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的表達(dá)結(jié)果類(lèi)似。同時(shí)COX回歸分析顯示，lncRNA-GAS5表達(dá)量的高低及腫瘤直徑對(duì)鼻咽癌患者的預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)能力。由此我們可以認(rèn)為，lncRNA-GAS5可作為鼻咽癌患者生存預(yù)后的血清生物學(xué)標(biāo)志。

總之，鼻咽癌患者血清中l(wèi)ncRNA-GAS5表達(dá)降低，其表達(dá)與鼻咽癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后、生存密切相關(guān)，此指標(biāo)可作為鼻咽癌患者新的預(yù)后標(biāo)志物。