痛風(fēng)患者發(fā)病危險因素及IL-1β基因啟動子區(qū)rs2853550位點多態(tài)性分析

張蓓，瑪依娜·卡哈爾，李瑞，梁美婷，宋睿睿，田婷婷，孫玉萍

新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆烏魯木齊 830011

痛風(fēng)是終生性疾病，單鈉尿酸鹽(MSU)晶體在關(guān)節(jié)內(nèi)的沉積是觸發(fā)急性痛風(fēng)的關(guān)鍵。MSU晶體沉積在關(guān)節(jié)周圍的組織，通過NALP3(NACHT，LRR和PYRIN結(jié)構(gòu)域的蛋白)激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而趨化中性粒細(xì)胞，并發(fā)生爆發(fā)式級聯(lián)擴(kuò)增反應(yīng)，刺激炎癥炎性信號[1]。NALP3炎性體可識別細(xì)胞內(nèi)的MSU晶體并激活蛋白酶-1，將IL-1β和IL-18前體轉(zhuǎn)換為活性形式，從而在高尿酸血癥患者誘發(fā)痛風(fēng)的炎癥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并由此導(dǎo)致一系列關(guān)節(jié)炎疾病的炎癥反應(yīng)[2]。IL-1是體內(nèi)作用最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一，參與很多炎癥性疾病的發(fā)病過程[3]。IL-1β是IL-1的主要分泌形式,是IL-1家族中行使生物學(xué)功能的主要炎性因子[4]。生理條件下IL-1β含量極低，但病理狀態(tài)下含量會增加，如痛風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化等都與IL-1β的上調(diào)密切相關(guān)[5-6]。痛風(fēng)發(fā)作的炎性機(jī)制目前認(rèn)為是由于單核/巨噬細(xì)胞吞噬了沉積在關(guān)節(jié)及其周圍組織中的尿酸鹽結(jié)晶以后，堿性磷酸酶(NALP3)炎癥體被激活，IL-1β和IL-1R進(jìn)一步被激活，趨化因子和IL-18等炎癥因子的分泌增加，從而導(dǎo)致痛風(fēng)炎癥反應(yīng)[7]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)種IL-1β基因多態(tài)標(biāo)記，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)rs2853550位點多態(tài)性與炎癥性疾病易感相關(guān)[8]，但在痛風(fēng)炎癥發(fā)生相關(guān)報道較少。2019年6—8月，我們對痛風(fēng)患者發(fā)病危險因素及IL-1β基因啟動子區(qū)rs2853550位點多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在探討IL-1β基因啟動子區(qū)rs2853550位點多態(tài)性與痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)性，目的是為痛風(fēng)的遺傳機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017—2019年新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治的痛風(fēng)患者314例(觀察組)，均為男性；年齡(47.63±12.04)歲。痛風(fēng)診斷具備下列臨床、實驗室和X線征象等12項中6項者即可確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)：1次以上的急性關(guān)節(jié)炎發(fā)作，炎癥表現(xiàn)在1 d內(nèi)達(dá)到高峰，單關(guān)節(jié)炎發(fā)作，患病關(guān)節(jié)皮膚呈暗紅色，第一跖關(guān)節(jié)疼痛或腫脹，單側(cè)發(fā)作累及第一跖趾關(guān)節(jié)，單側(cè)發(fā)作累及跗骨關(guān)節(jié)，有可疑的痛風(fēng)石，高尿酸血癥，X線顯示關(guān)節(jié)非對稱性腫脹，X線攝片示骨皮質(zhì)下囊腫不伴有質(zhì)侵蝕，關(guān)節(jié)炎癥發(fā)作期間關(guān)節(jié)液微生物培養(yǎng)陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：可導(dǎo)致核酸代謝亢進(jìn)的血液疾病，細(xì)胞破壞或增長加速的疾病如紅細(xì)胞增多癥、骨髓異常增生癥、多發(fā)性骨髓瘤、急慢性溶血性貧血、白血病、淋巴瘤，各種癌腫放療或化療后，腎臟非痛風(fēng)性結(jié)石，腎衰，其他腎臟疾病，近期服用雙氫克尿賽、吡嗪酰胺類等可促進(jìn)尿酸排泄的藥物。另選同期健康體檢者507例(對照組)，均為男性，年齡(46.14±13.24)歲。本研究所納入研究對象均知情同意并簽署同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 按照自行設(shè)計的調(diào)查問卷進(jìn)行現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，了解調(diào)查對象的家族史、疾病史、生活和飲食習(xí)慣等，同時采用年標(biāo)準(zhǔn)方法檢測身高、體質(zhì)量、BMI、腰圍、臀圍、腰臀比(WHR)、收縮壓和舒張壓等一般健康指標(biāo)。采集研究對象空腹靜脈血4 mL，其中2 mL不加抗凝劑，并于2 h內(nèi)分離血清，用7600全自動生化分析儀及配套試劑(日立公司)檢測血尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)等生化指標(biāo)。

1.3 IL-1β基因啟動子區(qū)rs2853550位點多態(tài)性分析方法 采用北京百泰克生物工程有限公司用Thermo Scientific King Fisher Duo全自動核酸提取儀(磁珠法)提取DNA樣品，并用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量，取吸光度(A260/280 nm)值在1.5～2.0，濃度>50 ng/μL的DNA樣品用于后續(xù)實驗。參考GenBank中IL-1β基因序列，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，并送上海天昊公司合成。采用上海天昊生物科技有限公司的SNPscanTM分型試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)：96 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、20 s,63 ℃、40 s,72 ℃、90 s，共9個循環(huán)；95 ℃、20 s,56 ℃、40 s,72 ℃、90 s，共25個循環(huán)；68 ℃、60 s，4 ℃取出。將擴(kuò)增產(chǎn)物十倍稀釋，各自添加1 μL以及0.5 μL的Liz500 SIZE STANDARD，與8.5 μL Hi-Di混合均勻，ABI3730XL測序儀檢測95 ℃、5 min變性混合液。使用Gene Mapper4.1軟件處理測序所得結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)發(fā)病單因素分析結(jié)果 觀察組BMI(26.69±3.33)kg/m2、WHR 0.94±0.06、SUA(508.57±118.14)μmol/L、舒張壓(71.16±11.58)mmHg、血糖PBG(5.80±1.82)mmol/L、TG(1.95±1.33)mmol/L、Cr(92.57±28.57)μmol/L、規(guī)律運動44例(14.01%)、肥胖89例(28.34%)、高血壓220例(70.06%)、糖尿病91例(28.98%)、高甘油三酯血癥96例(30.57%)、低密度脂蛋白血癥90例(28.66%)，對照組分比為(24.88±2.88)kg/m2、0.91±0.05、(338.44±49.8)μmol/L、(76.18±9.58)mmHg、(5.31±1.15)mmol/L、(1.66±1.14)mmol/L、(85.86±12.34)μmol/L、207例(40.83%)、72例(14.20%)、209例(41.14%)、53例(10.43%)、85例(16.77%)、11例(2.17%)，兩組比較，P均<0.05。

觀察組收縮壓(125.37±13.76)mmHg、TC(4.59±1.09)mmol/L、BUN(5.46±2.04)mmol/L、吸煙116例(36.94%)、飲酒118例(37.58%)、高膽固醇血癥19例(6.05%)，對照組分別為(124.65±13.64)mmHg、(4.65±0.89)mmol/L、(5.21±1.44)mmol/L、217例(42.81%)、217例(42.81%)、11例(2.17%)，兩組比較，P均>0.05。

2.2 痛風(fēng)發(fā)病多因素分析結(jié)果 痛風(fēng)發(fā)病多因素分析結(jié)果見表1，由表1可知，高血壓、糖尿病、高甘油三酯血癥、低密度脂蛋白血癥、肥胖、規(guī)律運動的偏回歸系數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，但I(xiàn)L-1β基因rs2853550位點不同基因型的偏回歸系數(shù)差異并無統(tǒng)計學(xué)意義；患有高血壓、糖尿病、低密度脂蛋白血癥患者罹患痛風(fēng)的危險較大，而規(guī)律運動使罹患痛風(fēng)的危險降低。

表1 痛風(fēng)發(fā)病多因素分析結(jié)果

2.3 痛風(fēng)患者IL-1β基因啟動子區(qū)rs2853550位點多態(tài)性分析結(jié)果 觀察組AA型1例(0.32%)、GA型52例(16.56%)、GG型261例(83.12%)、GG+GA型313例(99.86%)，rs2853550位點基因型頻率攜帶GA和GG基因型的人群發(fā)生痛風(fēng)的危險分別是攜帶AA基因型的7.12倍(OR值0.91～55.93)和8.50倍(OR值1.11～65.39)，加合模型分析發(fā)現(xiàn)攜帶GG+AA基因型的人群罹患痛風(fēng)的危險性是攜帶AA基因型的20.98倍(OR值2.72～161.60)。對照組分別為13例(2.56%)、95例(18.74%)、399例(78.70%)、494例(97.44%)，組內(nèi)各基因型比較，P均>0.05。

3 討論

痛風(fēng)是一種復(fù)雜性、終生性疾病，病情發(fā)展全過程可以分為四期，高尿酸血癥期患者無痛風(fēng)的臨床癥狀，僅表現(xiàn)為SUA升高，痛風(fēng)早期表現(xiàn)為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)中期形成慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，而痛風(fēng)晚期患者尿酸性腎病及腎結(jié)石有所發(fā)展，腎功能明顯減退，可出現(xiàn)氮質(zhì)血癥及尿毒癥。痛風(fēng)發(fā)病主要機(jī)制與嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致的高尿酸血癥有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組除舒張壓低于對照組，其余指標(biāo)均高于對照組，這與范鵬凱等[9]的研究一致。近年研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者常伴肥胖、超重、動脈粥樣硬化、冠心病、糖耐量異常、高血壓、血脂代謝紊亂等。因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，痛風(fēng)與肥胖、高脂血癥、高血壓、高血糖、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生有密切的相關(guān)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組肥胖、高血壓、糖尿病、高甘油三酯血癥、低密度脂蛋白血癥患病率均高于對照組，這與其他學(xué)者[9-10]研究一致，推測可能與體內(nèi)的氧化、過氧化損傷血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞增殖引起血管的長期慢性炎癥有關(guān)[12]。其中罹患低密度脂蛋白血癥患者發(fā)生痛風(fēng)的可能性是非低密度脂蛋白患者的16倍，是引起痛風(fēng)的危險因素，與朱剛等[13]報道一致，可能是與尿酸鹽直接作用于血管內(nèi)皮并激發(fā)其增生，由高尿酸血癥加重動脈粥樣硬化，誘發(fā)低密度脂蛋白分泌并沉積于血管內(nèi)皮有關(guān)。同時異常的血脂代謝產(chǎn)生的酮體會升高SUA，伴隨游離脂肪酸產(chǎn)生的副產(chǎn)物可降低SUA的排泄，從而是人體SUA升高，繼而加速胰島素β細(xì)胞破壞，加重糖尿病[14]。肥胖則可能引起胰島素抵抗，致使內(nèi)源性尿酸和外源性尿酸合成增加，增加痛風(fēng)的風(fēng)險。本研究還發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運動可降低痛風(fēng)發(fā)病的風(fēng)險，與2016年《中國痛風(fēng)診療指南》[15]中建議改變生活方式，增加規(guī)律運動有助于痛風(fēng)的預(yù)防和治療相吻合。

痛風(fēng)表現(xiàn)出明顯的遺傳特征，其發(fā)病和很多主效和微效基因有關(guān)，且受到環(huán)境因素的影響[16-17]。MSU晶體在關(guān)節(jié)內(nèi)的沉積是觸發(fā)急性痛風(fēng)的關(guān)鍵，MSU晶體沉積在關(guān)節(jié)周圍的組織，并通過NALP3(NACHT、LRR和PYRIN結(jié)構(gòu)域的蛋白)激活巨噬細(xì)胞，進(jìn)而趨化中性粒細(xì)胞，并發(fā)生爆發(fā)式級聯(lián)擴(kuò)增反應(yīng)，刺激炎癥炎性信號，NALP3炎性體可識別細(xì)胞內(nèi)的MSU晶體并激活蛋白酶-1，將IL-1β和IL-18前體轉(zhuǎn)換為活性形式，從而在高尿酸血癥患者誘發(fā)痛風(fēng)的炎癥機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。并由此而導(dǎo)致了一系列關(guān)節(jié)炎疾病的炎癥反應(yīng)[18]。所以作為人體作用最強(qiáng)的炎癥介質(zhì)之一的IL-1和IL-1β，其與痛風(fēng)的發(fā)病過程都密切相關(guān)。研究[19]表明，IL-1β是痛風(fēng)炎癥發(fā)生的驅(qū)動因素，在各種關(guān)節(jié)炎中起主要作用，其與炎癥反應(yīng)起始階段之間的關(guān)系也已非常清晰。本研究顯示，rs2853550位點基因型頻率攜帶GA和GG基因型的人群發(fā)生痛風(fēng)的危險分別是攜帶AA基因型的7.12倍和8.50倍，加合模型分析發(fā)現(xiàn)攜帶GG+AA基因型的人群罹患痛風(fēng)的危險性是攜帶AA基因型的20.98倍，推測攜帶該基因位點GG+GA基因型的人罹患痛風(fēng)的危險增加。rs2853550位點位點的AA基因型為痛風(fēng)的保護(hù)性因素，能降低痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險。

總之，痛風(fēng)的發(fā)病與糖尿病、高血壓、高血脂密切相關(guān)，規(guī)律運動使罹患痛風(fēng)幾率降低；IL-1β基因啟動子區(qū)rs2853550位點的基因突變可能與痛風(fēng)發(fā)病有關(guān)，攜帶GG+GA基因型的人群罹患痛風(fēng)的風(fēng)險增加。