苯并[a]芘復(fù)合降解菌群的構(gòu)建

蔡言紅,孫先鋒,周立輝,張琪雯,柴曉蝶,韓宇星

(1.西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048;2.長慶油田分公司 油氣工藝研究院,陜西 西安 710055)

0 引 言

落地油泥是指在原油開采或運輸過程中沒有進入集輸管線而散落在采油區(qū)地面的原油或從石油管線中泄漏并散落在地面上的石油所形成的污染土壤。由于落地油泥中的多環(huán)芳烴類物質(zhì)苯并[a]芘具有難以降解、存留周期長、毒性較大的特點,一旦進入環(huán)境,對土壤和生態(tài)環(huán)境將會造成極大的危害。落地油泥中的苯并[a]芘是由5個苯環(huán)組成的一種多環(huán)芳烴,為黃色針狀結(jié)晶體,分子式為C20H12,熔點179 ℃,沸點496 ℃,不溶于水,易溶于苯、乙醚、丙酮等有機溶劑[1-2]。苯并[a]芘分布廣泛,性質(zhì)穩(wěn)定,致癌性極強,被世界衛(wèi)生組織確定為一級致癌物質(zhì)[3-4],因此已成為目前國內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測方面重點關(guān)注問題[5-6]。有關(guān)文獻[7-8]研究表明,微生物會產(chǎn)生多種可以催化苯并[a]芘降解的酶類,且代謝速率較高。李鳳梅等研究發(fā)現(xiàn),細菌可以通過代謝的方式以PAHs為碳源滿足自身生長需求,但僅靠單一菌株很難完全降解,復(fù)合菌群的生物量和降解效果遠優(yōu)于單菌,尤其是對高環(huán)PAHs的礦化作用[9]。構(gòu)建復(fù)合菌群是提高苯并[a]芘降解率的關(guān)鍵[10-11]。相關(guān)研究顯示：① 復(fù)合菌群中各降解菌株，能提高對苯并[a]芘基質(zhì)的利用效率和范圍[12-13],從而實現(xiàn)對污染物的高效降解[14-15];② 復(fù)合菌群可以增加可降解底物的種類,并形成共生和共代謝系統(tǒng)[16-17];③ 較佳復(fù)合比例可以提高不同功能菌株之間相互協(xié)同作用。

本文以實驗室自主篩選并保存的優(yōu)勢多環(huán)芳烴降解菌株為基礎(chǔ),構(gòu)建可用于降解苯并[a]芘的復(fù)合菌群,研究各菌株對苯并[a]芘降解性能,為后期實現(xiàn)微生物復(fù)合菌群對多環(huán)芳烴的高效降解和有效去除提供參考。

1 實 驗

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司),THZ-82培養(yǎng)箱(PCECLSION),SF-TGL-16M高速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司),FA 1204B分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),HZQ-R恒溫振蕩箱(哈爾濱市東聯(lián)電子有限公司),7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司),SP-754紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

1.1.2 菌株來源 前期經(jīng)過落地油泥中菌株篩選、馴化、酶活性及其對苯并[a]芘降解、拮抗作用等一系列探究，已經(jīng)從9株菌中篩選出來生長周期相似，具有較高脫氫酶活性和雙加氧酶活性，對苯并[a]芘具有較高降解能力且相互之間無拮抗作用的優(yōu)勢多環(huán)芳烴降解菌，即YH-4假單胞菌屬(pseudomonassp.)、YH-6葡萄球菌屬(staphylococcussp.)和Da-6黃單胞菌屬(santhomonassp.)等。

無機鹽液體培養(yǎng)基:NH4NO32.0 g,K2HPO41.0 g,KH2PO40.5 g,無水CaCl20.02 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH為7.0,121 ℃,滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH7.0,121 ℃,滅菌20 min。

苯并[a]芘液體培養(yǎng)基:取所需量的苯并[a]芘-丙酮濃縮液加入到滅菌后冷卻至40 ℃左右的無機鹽液體培養(yǎng)基中,使其質(zhì)量濃度為50 mg/L,搖勻,等到丙酮揮發(fā)后待用。

苯并[a]芘固體培養(yǎng)基:在每升苯并[a]芘液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂,121 ℃,滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 降解菌的馴化 研究表明,經(jīng)過馴化的菌株降解能力會明顯增強,直至達到穩(wěn)定的最大耐受濃度[18]。本實驗以苯并[a]芘為唯一碳源,逐步提高碳源濃度,對降解菌進行馴化。取3株(YH-4、YH-6、Da-6)菌株，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后制備菌懸液。分別取5%菌懸液接入質(zhì)量濃度為10 mg/L苯并[a]芘液體培養(yǎng)基中,在35 ℃、120 r/min震蕩器上震蕩培養(yǎng),1個周期(7 d)后,從馴化體系中取出5%培養(yǎng)液繼續(xù)加至質(zhì)量濃度為20 mg/L苯并[a]芘液體培養(yǎng)基中。依此類推,每個周期苯并[a]芘按照10 mg/L的質(zhì)量濃度遞增,共培養(yǎng)4個周期。分別在馴化前期和馴化后期,取1 mL培養(yǎng)液,稀釋涂布,35 ℃避光培養(yǎng)48 h后進行平板計數(shù)[19]。

1.2.2 降解菌的降解特性 向各滅菌后的100 mL錐形瓶中分別加入50 mL苯并[a]芘液體培養(yǎng)基,使液體中苯并[a]芘質(zhì)量濃度稀釋至30 mg/L。同時，向不同錐形瓶中分別接入200 μL處于對數(shù)期的各降解菌菌懸液,在35 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)第2、4、6、8、10、12 d時，用GC-MS測定錐形瓶中苯并[a]芘降解率變化,采用紫外分光光度計法測定菌株的OD600值。具體提取和測定方法如下:①將液體培養(yǎng)基中的菌液加入30 mL二氯甲烷-丙酮(1∶1)混合溶液后轉(zhuǎn)移100 mL離心管中,在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min;②離心結(jié)束后,將上清液倒進旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液濃縮至約1 mL;③加入約3 mL正己烷,再濃縮至1 mL以下;④將溶劑完全轉(zhuǎn)換為正己烷,并準(zhǔn)確定容至1 mL于安捷倫瓶中,用GC-MS測定。

GC-MS測定條件為:

1)色譜條件：進樣口溫度280 ℃;進樣量1 μL,不分流進樣;柱流量1.0 mL/min(恒流);柱溫70 ℃保持2 min,以10 ℃/min速率升至120 ℃,保持0 min;再以6 ℃/min速率升至300 ℃,保持25 min。

2)質(zhì)譜條件:電子轟擊源EI;離子源溫度230 ℃;離子化能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍45～450 amu;溶劑延遲時間5 min;數(shù)據(jù)采集方式為全掃描模式。

1.2.3 響應(yīng)面法構(gòu)建復(fù)合菌群 分別以菌株YH-4、YH-6和Da-6的接種量(1%、1.5%、2%等3個接種水平)為自變量,以苯并[a]芘的降解率為響應(yīng)值,設(shè)計如表1所示的響應(yīng)面實驗。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌馴化結(jié)果

微生物對所處環(huán)境有一定的適應(yīng)能力,通過馴化,可以提高微生物適應(yīng)逆境的能力及對難降解物的降解能力。按照1.2.1方法,對YH-4、YH-6和Da-6進行馴化培養(yǎng),不同的苯并[a]芘馴化濃度下各菌株數(shù)量變化如圖1所示。

(a)YH-4 (b)YH-6 (c)Da-6

從圖1可以看出,隨著苯并[a]芘濃度增加,YH-4、YH-6和Da-6等3株降解菌最大數(shù)量均逐漸降低,當(dāng)苯并[a]芘質(zhì)量濃度達到50 mg/L時,各菌株均難以生長。表明苯并[a]芘對微生物生長起到了顯著的抑制作用。當(dāng)苯并[a]芘質(zhì)量濃度≤40 mg/L時,各菌株菌數(shù)均能達到106以上,滿足基本的微生物降解活性需求?？梢?降解菌YH-4、YH-6、Da-6具有良好的苯并[a]芘耐受能力,耐受質(zhì)量濃度最大達40 mg/L。

2.2 單一菌對苯并[a]芘降解能力

為了解單一菌株對苯并[a]芘的降解能力,分別將YH-4、YH-6、Da-6接種在苯并[a]芘質(zhì)量濃度為30 mg/L的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),定時檢測苯并[a]芘含量變化,計算出對應(yīng)的降解率,結(jié)果如圖2所示。

圖2 單一降解菌對苯并[a]芘的降解曲線

圖2中3條曲線趨勢相近,均為先快速上升,再趨于平緩。表明3株降解菌均對苯并[a]芘有一定的降解能力,且隨著時間的變化，降解率先升高,后平穩(wěn)。在第8 d,菌株Da-6對苯并[a]芘的降解率最高,為50.17%。這一數(shù)據(jù)也是3株菌降解率最高的,但效果不理想。這是由于苯并[a]芘具有5個環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),屬于難降解有機物,僅靠單一菌株難以實現(xiàn)對苯并[a]芘的有效去除。

2.3 響應(yīng)面法構(gòu)建復(fù)合菌群

復(fù)合菌群中各菌株間的最佳配比可以大大提高不同功能菌株之間相互協(xié)同作用,進而擴大多環(huán)芳烴的利用范圍和降解效率,還可有效避免當(dāng)前以菌種開發(fā)為主要研究方面的偶然性和隨機性[20]。以苯并[a]芘降解率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面設(shè)計實驗(表1),采用Design Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

(P<0.01)。

由表2、3可知,回歸模型的P<0.000 1,表明該模型極顯著(P<0.01)。A、B、C、AB、BC、A2、C2均對菌落數(shù)量有顯著影響(P≤0.05),而且影響順序依次為C>A>B,交互項AC、B2對菌數(shù)的影響不顯著(P>0.05),表明實驗因素對響應(yīng)值的影響為二次關(guān)系,苯并[a]芘降解率(Y)回歸方程為

Y=65.07+2.65A+1.31B+2.79C+

1.84AB-0.57AC-0.21BC-

4.30A2-1.60B2+2.18C2

失擬項P=0.173 8>0.05失擬不顯著,此模型選擇正確。該模型R2=0.974 1,說明回歸方程的擬合程度較好,可以應(yīng)用于3株降解菌接種量的理論預(yù)測。

圖3是不同因素交互作用對苯并[a]芘降解率的影響。從苯并[a]芘降解率影響來看:菌株YH-4接種量與YH-6接種量的P=0.007 3,且曲面陡峭,影響極顯著(P<0.01);菌株Da-6和YH-6接種量的P=0.044 5<0.05,對苯并[a]芘降解率影響顯著。

(a)YH-4與YH-6交互

綜合方差和響應(yīng)面立體分析校正計算結(jié)果,YH-4、YH-6、Da-6按照最佳接種量1.4%、1.4%、1.8%構(gòu)建復(fù)合菌群。菌株的安全性參照NY 1109—2006《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》標(biāo)準(zhǔn)要求,構(gòu)建復(fù)合菌群所用的菌株均屬于該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范疇之內(nèi),可以安全使用,并不會對人畜和環(huán)境造成生物安全風(fēng)險。

2.4 復(fù)合菌群對苯并[a]芘的降解

為驗證復(fù)合菌群降解能力,以YH-4、YH-6和Da-6所構(gòu)建的復(fù)合菌群對質(zhì)量濃度為30 mg/L的苯并[a]芘進行降解實驗。苯并[a]芘降解過程色譜圖變化如圖4所示。

圖4 復(fù)合菌群對苯并[a]芘的降解色譜圖

圖4橫坐標(biāo)為苯并[a]芘的出峰時間,縱坐標(biāo)為豐度值，是0、2、4、6、8、10、12 d加入復(fù)合菌群后,在培養(yǎng)第0、2、4、6、8、10、12 d后苯并[a]芘豐度的變化?？梢钥闯觯弘S著時間的增加,苯并[a]芘豐度(即苯并[a]芘的含量)逐漸降低；第12 d和第10 d的色譜曲線基本重合,即含量基本保持不變,表明復(fù)合菌群在12 d內(nèi)實現(xiàn)了對苯并[a]芘的良好去除。

復(fù)合菌群降解實驗過程中,質(zhì)量濃度為30 mg/L的苯并[a]芘降解率變化及培養(yǎng)液OD600值變化情況見圖5。

圖5 復(fù)合菌群對苯并[a]芘的降解

圖5表明,在復(fù)合菌群作用下,苯并[a]芘降解率和培養(yǎng)液OD600值均呈現(xiàn)顯著上升趨勢。復(fù)合菌群對苯并[a]芘的降解率最高為71.23%,遠高于圖2中單一菌株的最高降解率50.17%,說明3株菌同時存在提高了苯并[a]芘的降解率,降解效果明顯優(yōu)于單一菌株。培養(yǎng)液OD600值可以反映菌株以苯并[a]芘為碳源的生長繁殖情況,該數(shù)值越大,表明體系中的微生物數(shù)量越多,微生物越適應(yīng)此生長環(huán)境,對碳源的降解能力越強。圖5中前10 d OD600隨著時間的增加逐漸增大,10 d后開始趨于平緩,OD600最大達到0.42,說明復(fù)合菌群在自身生長繁殖的同時有效去除了體系中的苯并[a]芘。

3 結(jié) 論

1)將菌株YH-4、YH-6、Da-6進行苯并[a]芘培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)后,各菌株對苯并[a]芘耐受能力得到了顯著提升,最大耐受質(zhì)量濃度均可達40 mg/L,其抗逆能力明顯提高。

2)以苯并[a]芘降解率為響應(yīng)值,構(gòu)建復(fù)合菌群。構(gòu)建的復(fù)合菌群提高了對苯并[a]芘的降解率,為后期實現(xiàn)微生物復(fù)合菌群對多環(huán)芳烴的高效降解和有效去除提供幫助。