食管癌高危人群篩查的MDM2-BRCA2-MGMT自身抗體聯(lián)合檢測試劑盒研究

魏夢霞，雷玲玲，李學(xué)民，韓文莉，趙學(xué)科，孟超龍，胡守佳，程 錕,3，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉,3，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，吉佳佳，王偉鵬，王立東

食管癌(esophageal cancer,EC)是一種極具中國特色的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)57.2萬例，2/3發(fā)生在中國[1]，2015年中國食管癌發(fā)病率和死亡率均居消化道惡性腫瘤第二位[2]。臨床發(fā)現(xiàn)早期食管癌患者較少，95%患者就診時已為中晚期癌，5 a生存率僅為15%～20%[3]而臨床就診早期癌患者5 a生存率可達(dá)90%。篩選和建立用于大范圍無癥狀人群早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預(yù)警的指標(biāo)和方法，是提高食管癌早期發(fā)現(xiàn)率，降低食管癌死亡率的關(guān)鍵解決措施[4]。癌細(xì)胞在其發(fā)生和發(fā)展過程中會合成并釋放出一組其特有的分泌性抗原，即腫瘤相關(guān)抗原，因而患者血清中可能會存在這些抗原對應(yīng)的自身抗體，因此檢測患者血清中的自身抗體有助于癌癥病人高危人群預(yù)警和篩查[5]。同時，相關(guān)研究表明，腫瘤具有異質(zhì)性，即使同一腫瘤也可能有不同的抗原表達(dá)。目前，人們尚未找到針對某一腫瘤的單一分子標(biāo)志物，因此，與單個自身抗體檢測方法相比，用多種腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合檢測患者體內(nèi)自身抗體的表達(dá)情況，有利于提高針對某一腫瘤的檢出率。近年研究發(fā)現(xiàn)了一組食管癌特異相關(guān)蛋白分子指標(biāo)(MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白等)[6-7]，利用這些變異分子進(jìn)行優(yōu)化組合對食管癌高危人群進(jìn)行分子學(xué)檢測，并利用液體活檢技術(shù)首先確定無癥狀人群中的高危人群，再對這些高危人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡和黏膜靶向活檢及病理學(xué)檢查，是食管癌高發(fā)區(qū)大規(guī)模無癥狀人群癌前病變和早期癌篩查的重要策略之一。本研究采用自身抗體篩查技術(shù)對食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀食管癌人群進(jìn)行篩查應(yīng)用，為無癥狀食管癌高危人群預(yù)警篩查提供重要依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 分子指標(biāo)優(yōu)化組合ELISA試劑盒制備

1.1.1 第一組400例人群血清樣本檢測

ELISA試劑盒組成：MDM2、BRCA2和MGMT抗原包被的96孔酶標(biāo)板；樣品稀釋液：含有1%(W/V)BSA的PBST緩沖液；第二抗體稀釋液：含有1%(W/V)BSA的PBST緩沖液；酶標(biāo)抗原：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(Invitrogen公司)；顯色液：顯色液由顯色液A和顯色液B組成，其中，顯色液A為0.02%(W/V)TMB，顯色液B為0.006%(W/V)過氧化脲素；使用時將顯色液A和顯色液B按照1∶1等體積混合均勻；終止液：10%的硫酸；洗滌液：pH7.4的0.01 M的PBST(磷酸鹽)緩沖液；陽性對照血清：MDM2(BRCA2或MGMT)陽性對照血清；陰性對照血清：MDM2(BRCA2或MGMT)陰性對照血清，以上樣品分別包裝后與抗原包被的96孔酶標(biāo)板構(gòu)成食管癌早期篩查ELISA試劑盒。

取樣品血5 mL于10 mL離心管中，室溫靜置30 min后，2 000 r·min-1離心15 min，分離上層血清樣本0.1 mL并加入樣本稀釋液(1∶500稀釋，V/V)，將稀釋后的血清樣本加入已被抗原包被的96孔酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，每個孔的樣本添加量為0.1 mL，37 ℃孵化1 h，棄去反應(yīng)孔中液體，洗滌液洗滌5次以上。

辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體中加入第二抗體稀釋液(1∶40 000，V/V)，取0.1 mL加入96孔酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，37 ℃孵化50 min，棄去反應(yīng)孔中液體，洗滌液洗滌5次以上。

A顯色液和B顯色液等體積混合后取0.1 mL迅速加入至96孔酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，37 ℃避光孵化15 min，加入終止液0.05 mL，20 min內(nèi)于檢測波長450 nm和參比波長595 nm測定OD值，并用空白對照孔調(diào)零。

以陰性對照孔所測OD值得平均數(shù)加兩個標(biāo)準(zhǔn)差(Mean+2SD)為截斷值(cut-off值)，反應(yīng)孔中OD值讀數(shù)大于等于截斷值判斷為陽性，反應(yīng)孔中OD值讀數(shù)小于截斷值的判斷為陰性。

1.1.2 研究樣本信息收集正常人血清200份(對照組)和早期食管癌患者血清200份(食管癌組)，樣本來自于省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗室5.4萬樣本庫。對照組樣本人群男女比例1∶1，年齡(60±8)歲，該血清來自該重點(diǎn)實(shí)驗室合作意愿體檢中心的健康體檢人群，無腫瘤相關(guān)證據(jù)；食管癌組樣本人群男女比1∶1，年齡(52±10)歲，實(shí)驗組血清樣本均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為早期食管癌(0期和Ⅰ期)。

1.1.3 樣本處理對照組和食管癌組居民靜脈取血5 mL，室溫下靜置30 min后，2 000 r·min-1離心15 min，分離上層血清樣本0.1 mL，液氮保存12 h內(nèi)轉(zhuǎn)入實(shí)驗室，-80 ℃冰箱儲存。

1.2 第二組403例無癥狀人群篩查驗證

1.2.1 研究樣本在食管癌高發(fā)區(qū)河北省邯鄲磁縣，對志愿接受體檢的無癥狀居民進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，其中參與調(diào)查和體檢的居民共403人，男性212人，年齡(53±10)歲；女性191人，年齡(53±10)歲。流行病學(xué)調(diào)查前先由當(dāng)?shù)卮甯刹亢袜l(xiāng)村醫(yī)生幫助發(fā)放和講解知情同意書，對同意接受檢查的人開始詢問家族病史并進(jìn)行體檢，填寫基本信息調(diào)查表，包括各種腫瘤的家族史。所有被檢者均排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病等影響蛋白表達(dá)的疾病。

1.2.2 食管癌早期篩查對上述403例無癥狀居民靜脈取血5 mL，樣本處理步驟同1.1.3。對每個血清樣本進(jìn)行血清學(xué)檢測，具體檢測步驟同1.1.1。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測對上述403例無癥狀人群血清學(xué)檢測陽性和陰性居民均進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，并在常規(guī)的食管上段、中段和下段取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變部位取材，必要時進(jìn)行食管黏膜碘染色，在食管不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置85%乙醇固定。對色素內(nèi)鏡所取活檢組織全部固定、脫水、切片、HE染色，做組織病理學(xué)診斷。

1.3 第三組19 415例人群大規(guī)模篩查

1.3.1 研究樣本1973年以來，河北省多家城鄉(xiāng)醫(yī)院包括河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院等對磁縣食管癌高發(fā)區(qū)長期堅持下鄉(xiāng)普查，建立了多個腫瘤防治點(diǎn)，自2011年以來，對19 415例30～70歲無癥狀人群進(jìn)行食管癌高危人群和早期癌液體活檢篩查，其中男性9 615人，年齡(56±11)歲，女性9 800人，年齡(56±11)歲。

1.3.2 食管癌早期血清篩查對上述19 415例無癥狀人群進(jìn)行食管癌高危人群和早期癌液體活檢篩查，發(fā)現(xiàn)3 980例高危人群(20.50%，3 980/19 145)和15 435例非高危人群，對該3 980高危人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，取活體組織，并進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。3組樣本食管癌患者早篩過程如圖1所示。

圖1 食管癌患者早篩流程圖

2 結(jié)果

2.1 食管早期篩查ELISA試劑盒血清檢測3種自身抗體在食管癌組和對照組中的血清抗體檢測結(jié)果如表1所示。檢測后，食管癌組患者血清MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白抗體水平顯著高于對照組。食管癌組MGMT抗體表達(dá)陽性占13.75%，對照組MGMT抗體表達(dá)陽性占3.25%，食管癌組MDM2抗體表達(dá)陽性占18.50%，對照組MGMT抗體表達(dá)陽性占3.75%，食管癌組BRCA2抗體表達(dá)陽性占19.25%，對照組BRCA2抗體表達(dá)陽性占3.75%；3種自身抗體相比較，BRCA2抗體在食管癌組中的表達(dá)率明顯高于MDM2抗體，MGMT抗體表達(dá)率最?。辉谑彻馨┙M中，單一自身抗體表達(dá)陽性的人數(shù)明顯低于陰性人數(shù)，MGMT抗體表達(dá)陽性占13.75%，MGMT抗體表達(dá)陰性占36.25%；3種自身抗體OR值均大于1，表明MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白抗體三者均為患病的危險因素；P<0.001(SPASS 20.0)表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 3種自身抗體在食管癌組和對照組中的血清抗體檢測 例(%)

2.2 3種腫瘤相關(guān)抗體組合檢測結(jié)果3種腫瘤相關(guān)自身抗原自身抗體檢測結(jié)果如表2所示，可以看出隨著組合數(shù)目的增多，檢測靈敏度隨之升高，特異度不斷降低；3種自身抗體組合檢測靈敏度最高，高達(dá)89.50%，表明3種自身抗體組合檢測正確診斷為食管癌的概率為89.50%；3種指標(biāo)結(jié)合時檢測特異度仍能達(dá)到89.50%，表明非食管癌患者采用3種指標(biāo)聯(lián)合檢測時，被正確診斷為未患食管癌的概率為89.50%；采用MGMT、MDM2和BRCA2這3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體組合進(jìn)行食管癌早期診斷，在保證診斷特異度的前提下大幅度提高了診斷靈敏度；約登指數(shù)隨著腫瘤相關(guān)抗原組合數(shù)目的增多逐漸增大，趨于1，表明3種腫瘤相關(guān)組合指標(biāo)用于診斷腫瘤價值較大，該方法診斷和早期篩查食管癌應(yīng)用價值較高；采用MGMT、MDM2和BRCA2這3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體組合聯(lián)合檢測方法優(yōu)化組合，對食管癌高危人群進(jìn)行血清自身抗體檢測，首先確定無癥狀人群中的高危人群，既能保證較高的特異度，又能提高診斷靈敏度，對評估待測對象患食管癌的風(fēng)險具有較好的診斷和應(yīng)用價值。

表2 3種腫瘤相關(guān)抗原抗體檢測結(jié)果 例(%)

2.3 403例人群血清學(xué)和組織學(xué)檢測第二組高發(fā)區(qū)403例無癥狀人群年齡和性別分布如表3所示，男性總?cè)藬?shù)(205例)略高于女性總?cè)藬?shù)(199例)；無論是男性還是女性，主要年齡均分布在50～59歲，其次為60～69歲、40～49歲。對403例無癥狀人群進(jìn)行食管有色內(nèi)鏡檢查和食管上皮組織活檢，其中至少有一種自身抗體陽性者90例，3種自身抗體均為陰性者313例。此次403例無癥狀人群均自愿接受有色內(nèi)鏡檢查和食管上皮組織活檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)403例無癥狀人群中食管上皮正常346例，癌前病變41例。檢出早期食管癌14例，其中13例在自身抗體陽性組；檢出其他腫瘤2例，分別是自身抗體陽性組1例和自身抗體陰性率1例。自身抗體陽性組和自身抗體陰性組的色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果見表4。

表3 第二組高發(fā)區(qū)403例無癥狀人群食管癌早篩年齡性別分布 例(%)

表4 403例無癥狀人群血清自身抗體表達(dá)對比及食管內(nèi)鏡活檢病理人數(shù)結(jié)果 例(%)

2.4 第三組河北磁縣19 415例無癥狀人群食管癌早期篩查情況河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院與磁縣人民醫(yī)院聯(lián)合承擔(dān)國家“十一五”重大科技支撐項目“食管癌早診早治普查工程”，自2011年起，共對19 415例無癥狀人群進(jìn)行食管癌高危人群和早期癌液體活檢篩查，共發(fā)現(xiàn)3 980例高易感人群(20.5%，3 980/19 145)；對這些高危人群進(jìn)一步進(jìn)行色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理檢查，共發(fā)現(xiàn)1 553例癌前病變患者；626例上消化道腫瘤患者，包括582例食管癌和44例其他消化道腫瘤；582例食管癌患者中，早期食管癌占86.6%(504/582)。

3 討論

本研究通過檢測血清中3種食管癌相關(guān)抗原(MDM2、BRCA2和MGMT)，探討血清學(xué)檢測作為高危人群和早期食管癌篩查的可能性。本研究的優(yōu)勢在于，利用間接酶聯(lián)免疫吸附法對食管癌組和對照組進(jìn)行3種血清自身抗體檢測，發(fā)現(xiàn)3種血清自身抗體聯(lián)合檢測時其敏感性和特異性最優(yōu)，均為89.50%。本研究又在食管癌高發(fā)區(qū)對403例無癥狀人群行聯(lián)合血清自身抗體檢測，且對所有受試者行色素內(nèi)鏡檢測，提示多種食管癌相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理學(xué)檢查可能是食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀高危人群和早期發(fā)現(xiàn)的重要技術(shù)。本研究在食管癌高發(fā)區(qū)對19 415例無癥狀人群進(jìn)行大規(guī)模篩查，并對血清學(xué)檢查陽性受試者行色素內(nèi)鏡檢查，證實(shí)多種食管癌相關(guān)自身抗體聯(lián)合色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理學(xué)檢查可以有效檢出食管癌高危人群和早期癌，并且減少了內(nèi)鏡篩查范圍，降低了篩查成本，易于被受檢者接受。

本研究中的3種血清自身抗體是根據(jù)本實(shí)驗室或其他研究報道而選擇的，這些報道與食管癌都密切相關(guān)[8-10]，但其機(jī)制與自身抗體有關(guān)血清中的表達(dá)尚不明確。有關(guān)研究表明，頭頸部、肺癌等許多腫瘤都和血清中自身抗體的過表達(dá)密切相關(guān)[11-12]。在食管癌中，P53、C-myc、Koc等腫瘤相關(guān)自身抗體已被在血清中聯(lián)合檢測[4,13]，因此，優(yōu)化組合的血清自身抗體可用于篩查和早期診斷。

本研究基于MDM2、BRCA2和MGMT這3種優(yōu)化組合的血清自身抗體聯(lián)合色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理學(xué)檢查進(jìn)行病例對照研究，證實(shí)了該技術(shù)具有被廣泛推廣應(yīng)用的價值。單純血清自身抗體篩查容易出現(xiàn)假陽性，且不是臨床診斷食管癌的金標(biāo)準(zhǔn)。單純色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理學(xué)篩查范圍大、成本高，“陪伴檢查”現(xiàn)象嚴(yán)重，受試者不舒服且拒絕檢查，還需要經(jīng)驗豐富的內(nèi)窺鏡醫(yī)師[14]。因此，建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、患者可接受的篩查技術(shù)，首先篩查高危人群，然后進(jìn)一步進(jìn)行內(nèi)鏡檢查確定食管癌高危人群和早期癌是非常重要且必要的。

本研究結(jié)果表明，腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的組合可以顯著提高食管癌和高危人群篩查的敏感性和特異性。應(yīng)用這3種食管癌相關(guān)抗原自身抗體篩查河北磁縣食管癌高發(fā)區(qū)19 415例人群，通過對血清自身抗體陽性人群色素內(nèi)鏡精準(zhǔn)檢查，發(fā)現(xiàn)早期食管癌2.60%，相較于傳統(tǒng)內(nèi)鏡篩查早期癌患者的發(fā)現(xiàn)率2.00%～3.00%有所提高[15]，并且色素內(nèi)鏡檢查人群大幅度縮小，節(jié)省了大量普查工作的人力、物力和財力。更重要的是，利用該技術(shù)，可以精確篩出無癥狀的高危人群，能夠更精準(zhǔn)地進(jìn)行早防、早診和早治，提高早期食管癌的檢出率，延長食管癌患者的生存期，具有巨大潛在的社會效應(yīng)，非常值得推廣應(yīng)用。