STK15、P15和MLH1腫瘤相關(guān)抗原自身抗體液體活檢用于食管癌高危人群篩查研究

胡景峰，宋 昕，高社干，王 偉，3，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢(mèng)霞，韓文莉，雷玲玲，趙學(xué)科，孟超龍，胡守佳，程 錕,3，王盼盼，鐘 侃，孔國(guó)強(qiáng)，王立東

食管癌預(yù)后較差，中晚期患者術(shù)后5 a生存率僅為10%左右[1]，而手術(shù)切除治療的早期食管癌5 a生存率超過(guò)95%[1-2]。食管癌早期診斷和治療可以極大地延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，但早期食管癌患者無(wú)特異癥狀，就診時(shí)多已處于晚期，早期檢出率不足2%[3]。食管癌高危人群預(yù)警篩查和早期發(fā)現(xiàn)是降低食管癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵[3]。腫瘤相關(guān)抗原是一種發(fā)展迅速的腫瘤標(biāo)志物，是在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或是由機(jī)體對(duì)腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生和/或升高的，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生自身抗體，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類(lèi)物質(zhì)，為食管癌無(wú)創(chuàng)性液體活檢技術(shù)的研發(fā)提供了重要檢測(cè)指標(biāo)[4-5]。利用檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體的液體活檢技術(shù)篩查無(wú)癥狀高危人群和早期浸潤(rùn)食管癌是目前食管癌防治研究領(lǐng)域的重要研究課題之一[6-13]。本研究利用液體活檢篩查技術(shù)，進(jìn)行病例對(duì)照研究，并在高發(fā)區(qū)驗(yàn)證，評(píng)價(jià)液體活檢技術(shù)在食管癌高危人群預(yù)警篩查和食管癌早期發(fā)現(xiàn)中的意義。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象分為3組人群。第一組為來(lái)自省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室200份血清樣本，其中無(wú)任何腫瘤相關(guān)的證據(jù)正常人血清100份(正常組)，早期食管癌患者血清100份(食管癌組)。利用間接酶聯(lián)免疫法對(duì)兩組人群檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體STK15、P15和MLH1的表達(dá)情況。 第二組為在食管癌高發(fā)地區(qū)河南省新鄉(xiāng)市某地做流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)自愿接受血清學(xué)自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查的35歲無(wú)癥狀居民行相關(guān)檢查。第三組為2014至2019年在食管癌高發(fā)地區(qū)河南省洛陽(yáng)市某地食管癌篩查參與人群，對(duì)自愿接受血清學(xué)自身抗體檢查的35歲以上無(wú)癥狀居民行相關(guān)檢查。對(duì)血清學(xué)檢查陽(yáng)性者，經(jīng)受試者同意后行色素內(nèi)鏡和黏膜病理檢查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查在當(dāng)?shù)卣藛T和醫(yī)生的幫助下，為當(dāng)?shù)鼐用裰v解知情同意書(shū)，并幫助居民填寫(xiě)基本信息表。對(duì)自愿接受檢查的受試者排除患有傳染病、過(guò)敏及體質(zhì)較差者。

1.2.2 血樣采集與保存分別對(duì)每位受試者取空腹靜脈血5 mL，置于離心管內(nèi)，在室溫下靜置30 min后以2 000 r·min-1離心20 min，吸取血清，每管100 μL分裝，干冰保存，限時(shí)轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 自身抗體測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法為本實(shí)驗(yàn)室已建立的間接酶聯(lián)免疫吸附法[14]。

1.2.4 血清檢測(cè)結(jié)果判定采用Scripps研究所判定方法，Cut-off值(截?cái)嘀?取正常血清OD讀數(shù)的均數(shù)±3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，讀數(shù)大于截?cái)嘀禐殛?yáng)性，否則為陰性[15]。有一項(xiàng)自身抗體表達(dá)陽(yáng)性時(shí)，該受試者定義為食管癌高危人群。

1.2.5 胃鏡檢查常規(guī)行食管黏膜碘染色和賁門(mén)黏膜美藍(lán)染色，在食管不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于85%乙醇內(nèi)固定。

1.2.6 病理組織學(xué)檢查對(duì)胃鏡獲取的活檢組織常規(guī)處理后切片，每張厚5 μm，HE染色，作組織病理學(xué)診斷。

2 結(jié)果

2.1 研究流程對(duì)來(lái)自省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集的100份早期食管癌患者和100份正常人的血清進(jìn)行檢測(cè)；在食管癌高發(fā)地區(qū)河南省新鄉(xiāng)市某地作流行病學(xué)調(diào)查，有457位無(wú)癥狀居民接受了血清學(xué)檢測(cè)，457例接受了血清學(xué)檢查的居民中有52例拒絕接受色素胃鏡檢查，共405例受試者接受了色素胃鏡和黏膜病理檢查；在食管癌高發(fā)區(qū)河南省洛陽(yáng)市作食管癌大規(guī)模篩查，共對(duì)16 212例35歲以上無(wú)癥狀人群行血清學(xué)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體篩查，共有3 512例受試者發(fā)現(xiàn)3種自身抗體有至少1種陽(yáng)性，在這3 512例血清學(xué)檢查陽(yáng)性的受試者中，有416例拒絕接受胃鏡檢查，共3 096例受試者接受了色素胃鏡和黏膜病理檢查。

2.2 流行病學(xué)調(diào)查情況第一組100例正常人中，男性49例，女性51例，年齡35～69(52.47±9.87)歲；100例早期食管癌患者中，男性54例，女性46例，年齡40～78(60.87±7.65)歲。第二組同時(shí)接受血清學(xué)檢查和色素內(nèi)鏡檢查者共405例，其性別、年齡分布見(jiàn)表1。第三組共有無(wú)癥狀受試者16 212例，其中男性8 125例，年齡30～87(52,32±10.49)歲；女性8 087例，年齡30～91(53.02±10.49)歲。

表1 第二組受檢對(duì)象年齡與性別分布 例(%)

2.3 腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢查結(jié)果3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在食管癌組和正常組中的表達(dá)差異明顯，見(jiàn)表2；3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)區(qū)分食管癌組和正常組有較高的敏感度和特異性，見(jiàn)表3。

表2 3種自身抗體在早期食管癌患者和健康志愿者血清中表達(dá)差異分析

表3 不同自身抗體組合聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

2.4 血清學(xué)和胃鏡檢查結(jié)果對(duì)比第二組研究對(duì)象中，有405名無(wú)癥狀人群同時(shí)接受血清學(xué)檢查和色素內(nèi)鏡檢查，有87例血清學(xué)檢查抗體陽(yáng)性?？贵w陽(yáng)性者，色素內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)早期癌和不典型增生人數(shù)占比大于陰性組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 自身抗體表達(dá)對(duì)比食管色素內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果 例(%)

2.5 大規(guī)模篩查結(jié)果在高發(fā)區(qū)使用血清學(xué)液體活檢技術(shù)共對(duì)16 212例無(wú)癥狀人群進(jìn)行大規(guī)模篩查，受試者有至少一項(xiàng)自身抗體表達(dá)陽(yáng)性時(shí)定義為高危人群。檢測(cè)出3 512例高危人群，其中有3 096例自愿接受色素內(nèi)鏡檢查。接受色素內(nèi)鏡檢查的受試者中，有1 053例(34.01%)為食管上皮不典型增生，393例(12.69%)為早期食管癌，30例(0.97%)中晚期食管癌，47例(1.52%)其他消化道腫瘤。

3 討論

食管癌很高的發(fā)病率和死亡率嚴(yán)重危害著人民群眾的健康，但是經(jīng)過(guò)幾十年的研究，食管癌確切的發(fā)病機(jī)制并不清楚[14]，高發(fā)區(qū)食管癌的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下。中晚期食管癌5 a生存率只有10%～20%，而早期食管癌的5 a生存率可高達(dá)95%，食管癌的早期發(fā)現(xiàn)及早期診斷就尤為重要。目前，色素胃鏡檢查是高發(fā)區(qū)無(wú)癥狀人群食管癌篩查最有效的方法[16]，但內(nèi)鏡檢查程序復(fù)雜、費(fèi)用昂貴以及對(duì)受檢者有創(chuàng)傷，同時(shí)還需要有經(jīng)驗(yàn)的內(nèi)鏡醫(yī)師才能保證檢查結(jié)果的可靠性，這些原因造成高發(fā)區(qū)內(nèi)鏡篩查不能大規(guī)模推廣。目前，急需一種新的食管癌篩查方法改善早期癌篩查現(xiàn)狀。

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)緩慢的多階段、多因素演進(jìn)的過(guò)程，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的自身抗體。自身抗體存在于患者的血液、細(xì)胞或組織中，可通過(guò)免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法測(cè)定其含量，對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷具有一定的價(jià)值。通過(guò)血清學(xué)檢查自身抗體，使得早期診斷腫瘤成為一種可能[14]。本研究分別檢測(cè)了腫瘤相關(guān)抗原自身抗體(STK15、P15和MLH1)在食管癌患者和正常人血清中的表達(dá)情況，結(jié)果表明該組自身抗體在兩組中表達(dá)差異明顯，各個(gè)指標(biāo)在食管癌患者中陽(yáng)性率均高于正常人。其中，食管癌患者血清P15自身抗體陽(yáng)性率較正常人升高了14倍(29% VS 2%)，STK15和MLH1均較正常人升高了6倍(STK15∶38% VS 6%；MLH1∶37% VS 6%)。此外，3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)可以有效地區(qū)分食管癌患者和正常人群，敏感度和特異度分別為78%和 87%。表明該組自身抗體聯(lián)合檢測(cè)在食管癌篩查方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

在食管癌高發(fā)區(qū)新鄉(xiāng)某地應(yīng)用本研究發(fā)現(xiàn)的自身抗體組合對(duì)無(wú)癥狀人群進(jìn)行血清學(xué)和色素內(nèi)鏡篩查。在接受篩查的405例中，血清學(xué)自身抗體檢查陽(yáng)性87例(21.48%)，陰性318例(78.52%)；進(jìn)一步對(duì)405例行色素內(nèi)鏡和黏膜活檢發(fā)現(xiàn)，自身抗體陽(yáng)性組共檢出8例早期癌(9.20%)，29例不典型增生(33.33%)和49例正常上皮(56.32%)；自身抗體陰性組早期癌和不典型增生患者檢出率分別為2例(0.63%)和9例(2.83%)。兩組之間癌前病變與食管癌占比差異顯著，陽(yáng)性組中檢出食管癌占檢出總食管癌的80%，表明該組自身抗體聯(lián)合檢測(cè)可以將無(wú)癥狀人群中80%的食管癌區(qū)分出來(lái)，具有較高的篩查價(jià)值。本研究6 a間應(yīng)用自身抗體聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)在食管癌高發(fā)區(qū)洛陽(yáng)某地開(kāi)展了應(yīng)用性研究，共對(duì)16 212例無(wú)癥狀人群進(jìn)行食管癌篩查，對(duì)血清學(xué)篩查陽(yáng)性且自愿接受色素內(nèi)鏡檢查的 3 096例行色素內(nèi)鏡和黏膜活檢，共檢出393例早期食管癌(12.69%)、30例中晚期食管癌(0.97%)和1 053例不典型增生患者(34.01%)。本研究顯示自身抗體聯(lián)合檢測(cè)液體活檢技術(shù)結(jié)合色素內(nèi)鏡檢查食管癌檢出率可達(dá)2.61%，與單純應(yīng)用色素內(nèi)鏡篩查檢出率相近。本研究顯著減少了胃鏡檢查人數(shù)，降低了篩查成本。

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜多變的過(guò)程，由于腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性，如腫瘤之間病理類(lèi)型的差異、腫瘤細(xì)胞基因型及細(xì)胞表型之間的差異等導(dǎo)致食管癌癌變過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的腫瘤抗原，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生不同的自身抗體[14]。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究報(bào)道了大量的在食管癌患者和正常人中表達(dá)差異明顯的自身抗體，為構(gòu)建自身抗體食管癌篩查組合提供了分子基礎(chǔ)[4]。在不同的研究中分別報(bào)道了不同的自身抗體組合用于篩查食管癌癌前病變及早期食管癌患者[5，12，14]，與本研究相比，結(jié)果相似，但本研究發(fā)現(xiàn)的自身抗體組合應(yīng)用抗體數(shù)目更少，應(yīng)用更方便。本研究在無(wú)癥狀人群實(shí)際應(yīng)用時(shí)，發(fā)現(xiàn)有一部分癌前病變患者和食管癌患者抗體表達(dá)陰性，提示本自身抗體組合還存在一定的局限性，還需要探索發(fā)現(xiàn)新的自身抗體，優(yōu)化組合，提高檢測(cè)敏感度。

綜上所述，相對(duì)于單一指標(biāo)，STK15、P15和MLH1血清自身抗體聯(lián)合液體活檢檢測(cè)可以提高無(wú)癥狀人群癌前病變和早期食管癌的檢出率，是食管癌高危人群篩查的有效方法。相較于傳統(tǒng)色素內(nèi)鏡篩查早期食管癌，這一方法顯著減少了內(nèi)鏡檢查對(duì)象，降低了篩查成本，可以作為食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)的重要手段，具有明顯的人群推廣應(yīng)用價(jià)值。