銀杏葉提取物通過VEGF/PI3K/Akt1信號通路改善大鼠創(chuàng)傷性腦水腫

亢璐 鄭瑞 楊智航 張晉寧 王雪倩 陶藝

(沈陽醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034；2 2015級臨床9班)

由意外和突發(fā)原因?qū)е碌谋┝ψ矒?，常引起?chuàng)傷性腦損傷(TBI)，造成血腦屏障(BBB)結(jié)構(gòu)損傷和功能失調(diào)。創(chuàng)傷會引起腦組織內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物含量明顯增加，還原性物質(zhì)如維生素C、E減少及清除自由基的酶類物質(zhì)活性下降，使氧自由基、花生四烯酸代謝產(chǎn)物作用于腦微血管內(nèi)皮細胞的脂質(zhì)膜，破壞BBB完整性，提高滲透率，造成腦組織水腫，引起顱內(nèi)壓升高，甚至腦疝而危及生命〔1,2〕。銀杏葉提取物(EGb761)其主要成分銀杏黃酮具有強大的抗氧化與清除自由基的能力，可以在抗炎、擴張血管、改善外周循環(huán)等方面發(fā)揮藥效，廣泛用于心腦血管、神經(jīng)等系統(tǒng)疾病的防治和保健〔3〕。本研究通過給予創(chuàng)傷性腦損傷大鼠不同劑量的EGb761，探討其對創(chuàng)傷局部腦水腫的作用及可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 實驗動物購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001；健康成年SD大鼠64只，雌雄不限，體重200～250 g，采用隨機單位設(shè)計法將SD大鼠分為4組各16只：A組：假手術(shù)組；B組：TBI+等劑量生理鹽水組；C組：TBI+低劑量EGb761(25 mg/kg)組；D組：TBI+高劑量EGb761(50 mg/kg)組。實驗動物單籠飼養(yǎng)，12 h明暗循環(huán)，自由飲水進食，溫度(22±4)℃，相對濕度(50±4)%。

1.2主要試劑 EGb761注射液(臺灣濟生化學(xué)制藥廠股份有限公司)；β-actin單克隆抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)多克隆抗體(美國Proteintech公司)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體(VEGFR)2多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9多克隆抗體(武漢云克隆科技股份有限公司)；絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)1多克隆抗體(美國Affbiotech公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)；超氧化物陰離子熒光探針(DHE)(美國Sigma公司)。

1.3儀器 光學(xué)顯微鏡(德國Lecia公司)；生物組織脫水機(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)；生物組織包埋機(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)；生物組織攤烤片機(湖北慧達儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(德國BMG labtech公司)；Omega Lum C儀(美國Aplegen公司)；大鼠腦立體定位儀重力打擊器(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)。

1.4顱腦創(chuàng)傷動物模型的建立 大鼠稱重后，按0.3 ml/100 g給予10%水合氯醛麻醉，剃毛器備皮，碘伏消毒，俯臥位將鼠頭固定于腦立體定位儀，顱骨正中線切開頭皮2～3 cm，骨膜剝離干凈，充分暴露右頂骨，根據(jù)Feeney自由落體致傷法，以中線右旁3 mm，冠狀縫后3 mm處為圓心，用顱骨鉆開直徑5 mm骨窗(硬腦膜完整)，其上放置配套金屬墊片，40 g重錘從金屬墊片上方25 cm沿套管自由落下撞擊，造成大鼠顱腦損傷〔4〕。而后用適量骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，碘伏消毒，大鼠后腿肌注青霉素。假手術(shù)組大鼠不做重錘撞擊，其余操作相同。

1.5EGb761給藥方法 根據(jù)EGb761的臨床人體用量，按等效劑量系數(shù)折算法換算大鼠的等效劑量。在TBI傷后1 h，C組和D組大鼠分別按25 mg/kg和50 mg/kg腹腔注射EGb761，A、B組給予相同體積生理鹽水，連續(xù)給藥3 d。

1.6干濕重法測大鼠腦組織含水量 各組大鼠造模72 h后斷頭，分離損傷側(cè)腦組織，應(yīng)用電子天平精確稱量濕重(Ww)，而后將其放于烤箱內(nèi)，100℃烤24 h，應(yīng)用電子天平精確稱量干重(Dw)，按Elliott公式：腦組織含水量(%)=(Ww-Dw)/Ww×100%，計算腦組織含水量。

1.7DHE染色實驗 石蠟切片經(jīng)烤片及脫蠟，DHE用二甲基亞砜(DMSO)溶解，制成10 μmol/L的溶液，將DHE工作液滴加于切片，4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，滴加適量抗熒光淬滅封片劑，共聚焦顯微鏡下拍照，Image J軟件分析熒光強度。

1.8Western印跡檢測VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9表達水平 各組大鼠造模72 h后斷頭，取損傷灶周圍腦組織約100 mg剪碎，加入總蛋白提取液，用組織勻漿機勻漿，4℃下震蕩離心后取上清液，精確蛋白定量。各樣本等量總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉；加入VEGFR2(1∶200)、PI3K(1∶500)、Akt1(1∶500)、MMP-9(1∶200)、β-actin(1∶1 000)特異性抗體，4℃孵育過夜；TBST清洗3次，各5 min，加入羊抗兔二抗(1∶2 000倍稀釋)室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，各5 min，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，使用Omega Lum C儀顯影，Image J軟件分析目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度比值，代表目的蛋白的含量。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、SNK法。

2 結(jié) 果

2.1干濕重法測腦含水量 與A組(77.06±0.22)%相比，損傷72 h后，B組損傷側(cè)腦組織含水量(81.34±0.35)%、C組(79.62±0.15)%和D組(78.53±0.12)%，明顯升高(n=6，P<0.05)；與B組相比C組和D組損傷側(cè)腦組織含水量顯著降低(P<0.05)；D組損傷側(cè)腦組織含水量顯著低于C組(P<0.05)。

2.2氧自由基在大腦皮質(zhì)的表達 A組大鼠腦皮質(zhì)中DHE染色的平均熒光強度為(1.65±0.23)，與之相比，B組(2.97±0.17)、C組(1.82±0.10)和D組(1.76±0.20)平均熒光強度均顯著增高(n=4，P<0.05)；C組和D組平均熒光強度顯著低于B組(P<0.05)，且D組較C組平均熒光強度降低更為顯著(P<0.05)。見圖1。

2.3VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9在大腦皮質(zhì)中的表達 B、C和D組VEGFR2、PI3K、Akt1、MMP-9蛋白表達水平顯著高于A組(P<0.05)；與B組相比，C組和D組的VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；且D組各蛋白表達水平顯著低于C組(P<0.05)。見表1、圖2。

圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)DHE染色結(jié)果(×400)

表1 EGb761對大鼠腦組織中VEGFR2、PI3K、AKT1、MMP-9蛋白表達的影響

圖2 EGb761對大鼠腦組織中VEGFR2、PI3K、AKT1、MMP-9蛋白表達的影響

3 討 論

TBI引起腦組織水腫的本質(zhì)，是內(nèi)皮細胞間的連續(xù)性中斷(細胞旁途徑)和內(nèi)皮細胞的胞飲小泡增加(跨細胞途徑)，使毛細血管通透性增加〔5〕。TBI后創(chuàng)傷區(qū)腦含水量在傷后1 h已開始升高，水腫高峰出現(xiàn)于24～72 h，隨后逐漸下降〔6〕。TBI后1 h給予EGb761處理的C、D組大鼠腦水腫程度減輕，且呈劑量依賴性。

VEGF促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成，增加血管通透性〔7〕。VEGF的過度表達是TBI后血腦屏障崩潰，引發(fā)腦水腫及其他嚴(yán)重并發(fā)癥的常見原因之一〔8〕。VEGF通過激活VEGFR2，在抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的通透性和脈絡(luò)膜血管生成活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔9〕。以往研究證明，VEGF刺激VEGFR2的磷酸化，導(dǎo)致Akt的激活，并增加內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)和細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2的磷酸化，PI3K在VEGF/VEGFR-2信號通路中作用于Akt-eNOS上游〔10〕。VEGF通過與VEGFR2結(jié)合，進而激活細胞內(nèi)PI3K/Akt和ERK1/2信號通路，促使人腦微血管內(nèi)皮細胞中EphA2的表達，這有助于通過細胞旁途徑，增加人腦微血管內(nèi)皮細胞通透性〔11〕。PI3K通過多種神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子激活后，Akt在Thr308和Ser473位點磷酸化，通過合成或釋放MMPs，調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖遷移和血管通透性〔12〕。在糖氧剝奪離體腦缺血模型中，非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA可以通過激活本研究Toll樣受體(TLR)4/PI3K/Akt JNK1/2/14-3-3ε/NF-κB/MMP9通路，下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白，導(dǎo)致其功能紊亂，BBB通透性增加〔13〕。上述結(jié)果與本研究結(jié)果相一致，提示TBI可引起VEGF上調(diào)，與VEGFR2結(jié)合后，激活VEGF/PI3K/Akt1通路，上調(diào)MMP-9的表達水平，緊密連接通透性增加，導(dǎo)致腦水腫加重。

正常生理條件下，氧氣分子是穩(wěn)定的雙原子結(jié)構(gòu)，在受創(chuàng)傷、缺氧、紫外線等因素影響下，氧原子便會失去一個電子，由無害的氧變成非?；钴S的具有殺傷力的氧自由基，它與多種物質(zhì)發(fā)生作用，對細胞極具破壞性，常引起一系列連鎖反應(yīng)，使新陳代謝紊亂〔14〕；通常機體產(chǎn)生的少量氧自由基，可被體內(nèi)的抗氧化劑(如脂溶性的維生素E、水溶性的維生素C，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等)通過氧化還原反應(yīng)徹底清除〔15〕。但TBI誘導(dǎo)大量氧自由基產(chǎn)生時，可直接激活MMPs，下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白，上調(diào)水通道蛋白，導(dǎo)致BBB通透性增加，促進腦水腫〔16〕。本研究結(jié)果印證了這一事實。EGb761是通過特定的工藝和標(biāo)準(zhǔn)從干燥的銀杏葉中提取的具有多種有效藥用成分的混合物，具有抗炎、抗氧化、改變血液流變學(xué)、抗血小板聚集、參與免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護作用〔17〕。銀杏黃酮是EGb761的有效成分之一，具有強大的抗氧化和清除自由基能力，其通過清除超氧離子、羥自由基和脂質(zhì)過氧化自由基等，減少脂質(zhì)過氧化物的生成與沉積，阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，提高超氧化物歧化酶的活性，有效拮抗自氧由基對不飽和脂肪酸的破壞，阻止或抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起的病理性損傷〔18〕。奧拉西坦聯(lián)合EGb761可以安全有效地降低急性腦出血患者的腦水腫量，改善神經(jīng)功能〔19〕。本研究結(jié)果提示EGb761能夠有效緩解腦水腫，與其清除氧自由基的藥效有關(guān)。關(guān)于血管內(nèi)皮細胞生長抑制劑(VEGI，也被稱為TNFSF15)的研究發(fā)現(xiàn)，TBI可導(dǎo)致實驗動物BBB的破壞，損傷組織中VEGF/VEGI比值急劇升高。若在TBI早期給予VEGI，能夠下調(diào)VEGF的表達，抑制VEGFR2的激活，顯著降低血腦屏障通透性，恢復(fù)正常的VEGF/VEGI比值，同時可持續(xù)觀察到水腫減輕，神經(jīng)元細胞死亡減少，神經(jīng)功能改善〔8〕。噻唑烷二酮類藥物(羅格列酮)通過激活PI3K-Akt或-PKC，促進人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞遷移和調(diào)節(jié)通透性；同時羅格列酮增加了VEGF的表達，抑制了緊密連接蛋白〔連接黏附分子(JAM)-A和閉鎖連接蛋白(ZO)-1〕的表達，促進血管滲漏，引起周圍組織水腫；應(yīng)用Akt抑制劑后，上述現(xiàn)象減弱〔20〕。本實驗結(jié)果提示EGb761可能具有類似作用，可以抑制VEGF/PI3K/Akt1信號通路，下調(diào)MMP-9表達，通過促進微血管的形成，改善BBB通透性，從而緩解創(chuàng)傷引起的腦水腫，為提高TBI療效提供新的思路。