YAP抑制劑對慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響

盧洪飛 張敏鴻 楊建瓊 羅耀玲

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000；2臨床醫(yī)學(xué)研究中心)

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種由費(fèi)城染色體陽性的造血干細(xì)胞克隆擴(kuò)增導(dǎo)致的骨髓增生性腫瘤，CML的發(fā)病機(jī)制與融合基因BCR-ABL1的表達(dá)有關(guān)，融合基因BCR-ABL1編碼是具有酪氨酸激酶(TK)活性的BCR-ABL蛋白，促進(jìn)白血病細(xì)胞加重骨髓增生和抗凋亡〔1〕。由于白細(xì)胞增殖凋亡失衡、細(xì)胞分化失調(diào)，導(dǎo)致大量不成熟白細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血。目前，TK抑制劑(TKIs)作為CML治療的臨床一線用藥，顯著提高了患者生存率，但仍存在部分患者對TKIs耐藥或不耐受〔2〕。因此，尋找新的靶標(biāo)基因是目前CML治療領(lǐng)域亟需解決的問題之一。

細(xì)胞的生長凋亡受細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精密調(diào)節(jié)，腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展與多種信號(hào)通路異常失活密切相關(guān)。CML的發(fā)生及進(jìn)展中Wnt、Notch、Hedgehog、Hippo信號(hào)通路等多條信號(hào)通路失調(diào)〔3,4〕。Hippo信號(hào)通路是一個(gè)協(xié)調(diào)正常細(xì)胞增殖、死亡和分化，調(diào)控組織生長的高度保守的生長控制信號(hào)通路，其失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔5〕，YAP是Hippo信號(hào)通路關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中異常表達(dá)。本研究擬分析YAP抑制劑維替泊芬通過抑制Hippo信號(hào)通路對CML細(xì)胞系K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo、Forma 311)、潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，上海博迅)、生物顯微鏡(Olympus，BX 41)、蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra)、流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACSCalibur)、顆粒制冰機(jī)(三洋，SIM-F140)、低速冷凍離心機(jī)(中佳，KDC-2046)、連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，Varioskan Flash)、超純水儀(Millipore，RiOs5+Milli-Q Biocel)、萬向脫色搖床(北京六一，WD-9405B)等。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑 K562細(xì)胞系(由贛南醫(yī)學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心保藏提供)；RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；噻唑藍(lán)(MTT)粉劑(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；Bax、Bcl2一抗(美國Abcam公司)；Western印跡相關(guān)試劑、β-actin一抗(上海碧云天公司)；維替泊芬(Selleck)等，所有化學(xué)試劑為分析純。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮貯存的K562細(xì)胞，37℃快速融化進(jìn)行復(fù)蘇，含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基置于5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，1 000 r/min離心5 min離心傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4MTT比色法測細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞至合適濃度，接種4×103個(gè)細(xì)胞于96孔板；分為調(diào)零組、空白對照組、藥物處理組，各孔均重復(fù)3次，維替泊芬工作濃度依次為1、2、4、8、16 μmol/L，96孔中最終工作體積200 μl，二甲基亞砜(DMSO)含量不高于0.1%；細(xì)胞置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心5 min，吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；酶標(biāo)儀測量各孔OD 570 nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%，根據(jù)GraphPad Prism6.0軟件計(jì)算維替泊芬作用K562細(xì)胞24 h半數(shù)抑制濃度(IC50)值，選擇合適濃度范圍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞檢測法 1 000 r/min離心5 min收集4、8、16 μmol/L維替泊芬作用24 h后細(xì)胞；預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min洗滌；加入300 μl 1倍結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；加入5 μl PI染色后1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。Annexin V-FITC陽性細(xì)胞群為凋亡細(xì)胞，計(jì)算其占細(xì)胞總數(shù)比例，即為細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析。

1.6Western印跡 1 000 r/min離心5 min收集4、8、16 μmol/L維替泊芬處理24 h后的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量總蛋白濃度；12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每泳道上樣蛋白量為50 μg，80 V恒壓2 h；200 mA恒流濕轉(zhuǎn)1 h至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；室溫5%脫脂牛奶封閉30 min；4℃搖床孵育稀釋合適濃度的一抗過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；4℃搖床孵育稀釋合適濃度的對應(yīng)二抗4 h；TBST洗膜3次，每次10 min；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，手動(dòng)曝光，掃描膠片，Image J軟件分析目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值比值，計(jì)算相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、2、4、8、16 μmol/L維替泊芬濃度作用K562細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞增殖抑制率呈劑量及時(shí)間依賴性(P<0.05)，處理24 h時(shí)，IC50值為11.80 μmol/L，選擇4、8、16 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見表1。

2.2流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果 4、8、16 μmol/L維替泊芬作用K562細(xì)胞24 h后，單因素方差分析顯示組間比較差異顯著(F=59.09，P<0.05)。細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴分別為(8.86±0.99)%、(16.54±0.45)%、(27.08±4.41)%，與對照組(3.49±0.61)%比較，K562細(xì)胞凋亡率在8、16 μmol/L維替泊芬作用24 h后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

表1 不同濃度維替泊芬不同時(shí)間作用K562細(xì)胞的增殖抑制率

圖1 維替泊芬促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡

2.3Western印跡檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4、8、16 μmol/L維替泊芬作用K562細(xì)胞24 h后，促凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)隨維替泊芬濃度增加而升高，分別為對照組的1.14±0.08、1.28±0.06、1.74±0.11倍，單因素方差分析顯示組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.56，P<0.05)，8、16 μmol/L時(shí)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)隨維替泊芬濃度升高而降低，分別為對照組的0.75±0.09、0.54±0.07、0.36±0.08倍，單因素方差分析顯示組間比較差異顯著(F=47.11，P<0.05)，4、8、16 μmol/L時(shí)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 維替泊芬對K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響

3 討 論

維替泊芬是一種用作光動(dòng)力療法的光敏劑藥物，于2000年被FDA批準(zhǔn)用于治療年齡相關(guān)的黃斑變性〔6〕。研究表明，維替泊芬能夠抑制YAP-TEAD相互作用，抑制Hippo信號(hào)通路活性，抑制YAP誘導(dǎo)的肝臟過度生長〔7〕。Hippo信號(hào)通路是一條進(jìn)化高度保守的信號(hào)通路，在哺乳動(dòng)物中對調(diào)節(jié)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、器官大小和腫瘤發(fā)生至關(guān)重要〔5〕。Hippo信號(hào)通路失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化失調(diào)等，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展〔8〕。YAP是Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)器之一，主要通過與TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活作用，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)。研究表明，YAP在多種人類腫瘤中過度表達(dá)，并增加其核定位，包括結(jié)腸癌〔9〕、肺癌〔10〕、卵巢癌〔11〕、肝癌〔12〕、胃癌〔13〕等，表明YAP作為致癌基因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移及不良預(yù)后相關(guān)。因此，特異性抑制YAP-TEAD相互作用，抑制YAP核蓄積，為抗癌治療提供新的分子靶點(diǎn)。

CML是一種造血干細(xì)胞克隆擴(kuò)增導(dǎo)致的骨髓增生性腫瘤，目前，臨床主要采用TKIs靶向TK治療CML，但晚期CML、對TKIs耐藥、不敏感這部分患者仍然是治療CML急需解決的困難之一。近年國內(nèi)外研究表明，Hippo信號(hào)通路異常激活與包括CML在內(nèi)的白血病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔4,14,15〕，但Hippo信號(hào)通路在CML發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及YAP抑制劑維替泊芬對CML細(xì)胞生物學(xué)功能的作用文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示維替泊芬作用K562可抑制其增殖，且呈時(shí)間及劑量依賴性，表明Hippo信號(hào)通路在K562細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，特異性抑制Hippo信號(hào)通路可抑制CML細(xì)胞K562增殖；流式檢測結(jié)果顯示維替泊芬作用K562促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨濃度的增加而升高，Western印跡結(jié)果顯示維替泊芬作用K562細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制可能為維替泊芬抑制Hippo信號(hào)通路活性后，使得Bcl-2表達(dá)抑制，促進(jìn)Bax表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究表明，維替泊芬作用K562細(xì)胞，可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，細(xì)胞增殖抑制可能與凋亡促進(jìn)有關(guān)。

總之，Hippo信號(hào)通路在包括CML在內(nèi)的多種惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病中異常激活，與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。在CML中Hippo信號(hào)通路異常激活，通過Hippo信號(hào)通路YAP抑制劑維替泊芬靶向抑制Hippo信號(hào)通路活性，可以抑制細(xì)胞增殖、凋亡，或許可為CML靶向治療補(bǔ)充思路。維替泊芬可特異性抑制YAP-TEAD相互作用，抑制Hippo信號(hào)通路，其或許可成為CML治療的一種老藥新用化療藥物。