衰老對小鼠角膜厚度和眼表的影響

章爽 高桂平 黎彪 李秋玉 葛倩敏 梁榮斌 石文卿 邵毅

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，江西 南昌 330006)

隨著年的增加引發(fā)的與年齡有關(guān)的慢性疾病不斷增加，其中，老年干眼癥患病率呈逐年增長趨勢〔1〕，目前國內(nèi)針對老年人干眼的發(fā)病危險因素的研究文獻(xiàn)較少，衰老如何參與老年干眼發(fā)病過程的機(jī)制及是否會導(dǎo)致角膜結(jié)構(gòu)及角膜厚度變化仍不清楚，本文通過眼前段光學(xué)相干斷層掃描血管成像(OCTA)檢測衰老對嚙齒動物小鼠所引起角膜厚度變化及通過相關(guān)技術(shù)檢測衰老對小鼠基礎(chǔ)淚液分泌試驗(SIT)、淚膜破裂時間(BUT)、角膜熒光素染色(FL)評分的影響，進(jìn)而進(jìn)行相關(guān)性分析以評估臨床和體外測量之間的潛在關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取12只由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供的健康的、體重為18～21 g、鼠齡為6周齡的雌性C57小鼠(均為 SPF 級實驗動物)，使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節(jié)、眼底無異常，飼養(yǎng)至2月齡和24月齡時分別進(jìn)行實驗。在研究過程中，保持在標(biāo)準(zhǔn)化的環(huán)境中飼養(yǎng):恒溫為(23±1)℃，相對濕度60%±5%，12 h明暗周期中(早上8∶00到晚上8∶00)，小鼠均給予相同的水量和食物，對實驗動物的使用和喂養(yǎng)均符合動物倫理學(xué)并遵循 《 實 驗 動 物 管 理 條 例 》，在實驗過程中盡可能減少實驗動物的應(yīng)激，處置動物時盡量減少實驗動物的痛苦和傷害〔2〕，由于月齡為24月齡的C57小鼠的年齡相當(dāng)于一個大約65歲的人類，這可能會提供關(guān)于衰老如何影響人類眼表的關(guān)鍵見解〔3〕，取24月齡小鼠為研究對象，以小鼠年齡變化作為自身對照，實驗分為A、B兩組，均取小鼠右眼作為實驗眼，A組為飼養(yǎng)至2月齡C57小鼠(12只)，B組飼養(yǎng)至24月齡C57小鼠(12只)。

1.2實驗方法

1.2.1BUT檢測 根據(jù)文獻(xiàn)〔4〕下方結(jié)膜囊內(nèi)滴入1滴 1% 熒光素鈉溶液，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察，正常的角膜上皮不染色，染為綠色代表角膜上皮缺損，記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)第1個破裂點的時間。

1.2.2SIT檢測 根據(jù)文獻(xiàn)〔5〕下方結(jié)膜囊內(nèi)滴一滴鹽酸丙美卡因(愛爾凱因)滴眼液表面麻醉后,在小鼠右眼外眥中外1/3交點的地方放置酚紅棉線(天津京明新技術(shù)發(fā)展有限公司，中國天津)的一端，線的邊緣輕輕鉤住下眼瞼，并計時60 s,指示卡顏色由黃色變紅色時立即測量，用游標(biāo)卡尺測量酚紅棉線紅色部分的潤濕長度(以mm為單位)，計算淚液分泌量。

1.2.3FL測定及評分 根據(jù)文獻(xiàn)〔6〕方結(jié)膜囊內(nèi)滴入1滴1%熒光素鈉溶液,使其瞬目，觀察裂隙燈鈷藍(lán)色光下角膜上皮著染，參考國家眼科研究臨床干眼評分系統(tǒng)〔7〕，分為 0 ～4分：0分：沒有染色；1分：輕微點狀著染，少于30點；2分：點狀染色超過30點，但沒有成片；3分：嚴(yán)重彌漫性染色，但沒有斑塊；4分：有熒光素斑塊。

1.2.4角膜上皮及全層厚度 所有小鼠角膜厚度的測量采用 AngioVue OCTA 系統(tǒng)，模式調(diào)為視網(wǎng)膜成像模式(AngioRetina 模式)，采用分頻輻去相關(guān)血管造影算法(SSADA) 進(jìn)行成像〔8〕，橫向分辨率設(shè)置為 15 μm，軸向分辨率設(shè)置為 5 μm，并使用前段透鏡光學(xué)適配器鏡片，采用 840 nm 波長、寬度22 μm 的光源獲取 3D 掃描圖像〔9〕，對所選小鼠進(jìn)行檢測時，由于OCTA 系統(tǒng)默認(rèn)的聚集是針對視網(wǎng)膜，所以在測量角膜全層及角膜上皮厚度時要關(guān)閉自動聚焦功能〔10,11〕，確定掃描中心，雙眼定期給予生理鹽水滴眼液，以維持角膜水合。以上實驗，進(jìn)行每次檢查時應(yīng)注意控制變量，實驗應(yīng)由同一技師在相同的時間、地點，相同的照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組SIT、BUT和FL評分比較 B組BUT 明顯短于A組，SIT明顯長于A組，F(xiàn)L評分明顯高于A組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組SIT、BUT 和 FL 評分比較

2.2兩組角膜上皮厚度和角膜全層厚度比較 角膜較清亮，晶狀體尚清，B組角膜稍水腫，可見晶狀體混濁。見圖1。B組平均上皮厚度小于A組，而平均角膜全層厚度大于A組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見圖2、表2。

圖1 兩組角膜眼前節(jié)及角膜熒光染色(×16)

圖2 兩組小鼠角膜上皮及全層厚度測量(×16)

表2 兩組角膜厚度比較

2.3兩組角膜極值比較 兩組角膜厚度及角膜上皮厚度均有顯著差異(P<0.05)，但兩組角膜厚度及角膜上皮(MIN-MAX) 差值比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。見表3。

表3 兩組角膜上皮和角膜厚度極值比較

3 討 論

干眼癥為任何原因所致淚液質(zhì)或量，或動力學(xué)的異常，從而導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適和(或)眼表組織損害為特征的多種疾病的總稱。干眼患者輕者常表現(xiàn)為眼部干澀感，異物感、燒灼感及視疲勞等，重者可導(dǎo)致角膜上皮損害并形成角膜新生血管〔12〕，干眼是一種復(fù)雜的影響眼表和淚腺的多因子疾病，主要由細(xì)胞凋亡、炎癥及性激素水平失調(diào)等機(jī)制所致〔13〕，清楚了解病因?qū)⒂兄诒静〉姆乐巍?/p>

正常的眼表和淚腺組織均有豐富的神經(jīng)支配，通過完整的神經(jīng)反射環(huán)路完成淚液分泌功能，由于環(huán)境變化引起的角膜傳入神經(jīng)元的激活可增加了基底淚液的分泌，但與此矛盾的是，有研究表明，淚液分泌增加與中央和外周角膜的基底下神經(jīng)叢(SBNP)和表面神經(jīng)末梢(SNTS)的神經(jīng)總和長度減少相關(guān)，多模態(tài)角膜神經(jīng)的亞突起主要表達(dá)瞬時受體電位(TRP)M8或TRP陽離子通道Ⅴ亞家族成員(TRPV)1傷害性感受器〔14〕，TRPM8角膜神經(jīng)主要參與淚液調(diào)節(jié)及負(fù)責(zé)角膜表面冷卻，通過對嚙齒動物相關(guān)研究，老化可能使這些冷感受器發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，并且隨著年齡的增加，數(shù)量會減少〔15〕，因此，老年小鼠較高的淚液分泌可能與TRPM8特異性神經(jīng)信號的減少有關(guān)，此外，隨著年齡的增大，鼻淚管結(jié)構(gòu)的改變會導(dǎo)致較低的淚液排泄率〔16〕，推測老年小鼠較高的淚液分泌可能與TRPM8特異性神經(jīng)信號的減少及鼻淚腺系統(tǒng)的變化有關(guān)，這使得衰老小鼠的淚液分泌較多。

雖然老年小鼠有較高的淚液分泌量，但在我們實驗中觀測到，老年小鼠的BUT縮短，這是由于淚膜層由脂質(zhì)層，水液層，黏蛋白層三層組成，淚膜厚度較薄，僅約3 μm〔17〕，因此更容易發(fā)生損傷，隨著年齡的增加，淚腺和瞼板腺可能會發(fā)生導(dǎo)管周圍纖維化，腺泡細(xì)胞萎縮和淋巴細(xì)胞浸潤等變化，此外，淚腺及瞼板腺的分泌還受到激素的影響，雄激素可以增加淚腺分泌，同時還可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)瞼板腺的分泌〔18〕，在一些雌性患者中，隨著年齡的增加，體內(nèi)的激素水平越來越低，這使得瞼板腺、淚腺的分泌功能也逐漸降低，而瞼板腺的功能降低會使脂肪層完整性的降低〔10，19〕，脂肪層在調(diào)節(jié)眼表淚膜蒸發(fā)中起著關(guān)鍵作用，雖然老年小鼠的水液層增多，但脂質(zhì)層是減少會造成淚膜的穩(wěn)定性降低，淚膜容易破裂，這使得衰老小鼠淚膜更容易破裂。

角膜是機(jī)體神經(jīng)末梢分布密度最高的器官之一，豐富的感覺神經(jīng)來源于三叉神經(jīng)的眼支，感覺神經(jīng)纖維從睫狀神經(jīng)長神經(jīng)發(fā)出分支，穿過前彈力層在上皮下形成上皮下神經(jīng)叢，從基底下神經(jīng)叢開始，垂直方向的軸突向前突出，終止于淺上皮，這使得角膜敏感度較高，有研究表明，小鼠淺上皮和基底區(qū)角膜神經(jīng)總和長度和垂直神經(jīng)投射密度會隨著年齡的增長顯著降低，而與此移植的是小鼠的機(jī)械角膜敏感度隨著年齡的增長而降低，這與基底下神經(jīng)軸突的密度降低是相平行〔19〕，角膜神經(jīng)可以檢測外界傷害，有害物質(zhì)及溫度，從而做出相應(yīng)的反射，減少傷害，隨著年齡的增加，角膜神經(jīng)支配減少，這使得角膜保護(hù)機(jī)制降低，從而容易受到角膜損傷，本實驗發(fā)現(xiàn)老年小鼠的上皮厚度降低，F(xiàn)L增加可能與年齡引起的角膜神經(jīng)減少所造成的角膜防御機(jī)制降低有關(guān)。

使用OCTA來評估角膜結(jié)構(gòu)過程中，發(fā)現(xiàn)老年小鼠上皮厚度變薄，而角膜全層厚度增厚，由于老年小鼠淚膜穩(wěn)定性降低，同時加上各種炎癥因子的影響，使得角膜基質(zhì)活性代償性增強(qiáng)，膠原纖維開始合成，使得角膜基質(zhì)層增厚，此外，角膜內(nèi)皮層的Na+-K+-ATP 酶泵維持基質(zhì)層的半脫水狀態(tài)，使角膜保持透明狀態(tài)，隨著年齡的增加，角膜內(nèi)皮數(shù)量隨著年齡增加而減少，細(xì)胞代償性增加，Na+-K+-ATP 酶泵功能相對降低，導(dǎo)致角膜基質(zhì)層水腫增厚，而基質(zhì)細(xì)胞所組成的基質(zhì)層占角膜厚度的 90%，因此這使得角膜上皮全層厚度也相應(yīng)地增厚〔20〕，因此推測這可能是衰老引起角膜全層厚度增加的原因。

綜上，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對老年干眼患者的重視，了解發(fā)病高危因素，及時采取相應(yīng)的防治措施，及時治療，從而提高老年人的生活質(zhì)量。