miR-486-5p靶向TRPM2對(duì)帕金森病模型細(xì)胞自噬和凋亡的影響

彭秀華 柳明杰

(1錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；2錦州醫(yī)科大學(xué))

帕金森病(PD)是臨床常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病，常發(fā)生于老年人群，其主要病理特征為基底神經(jīng)節(jié)中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的退化及進(jìn)行性缺失，調(diào)查研究顯示PD發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量〔1〕。既往研究顯示線粒體功能障礙、炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔2〕。微小RNA(miRNA)可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)而參與人類多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，研究表明miRNA在PD患者異常表達(dá)并可調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、自噬及分化等過(guò)程〔3〕。目前PD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因而探究PD發(fā)病機(jī)制及尋找治療靶點(diǎn)具有重要意義。研究表明miR-486-5p在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中下調(diào)表達(dá)，miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用〔4〕。研究表明miR-486-5p在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞中表達(dá)水平降低，miR-486-5p過(guò)表達(dá)可抑制炎癥因子的表達(dá)〔5〕。但miR-486-5p在PD模型細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)PD模型細(xì)胞自噬、凋亡的影響尚未可知。Targetscan預(yù)測(cè)顯示瞬時(shí)受體電位(TRP)M2可能是miR-486-5p的靶基因，研究表明PD患者與1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中TRPM2的表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔6〕。相關(guān)報(bào)道指出下調(diào)TRPM2的表達(dá)可保護(hù)缺血性大鼠腦損傷〔7〕。但miR-486-5p是否通過(guò)靶向調(diào)控TRPM2的表達(dá)影響PD模型細(xì)胞自噬、凋亡尚未可知。本研究主要探討PD細(xì)胞模型中miR-486-5p的表達(dá)水平變化，分析其對(duì)PD細(xì)胞模型自噬及凋亡的影響，初步探究miR-486-5p對(duì)TRPM2的調(diào)控作用，為揭示PD發(fā)病機(jī)制提供新方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 MPP+購(gòu)自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司；人SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶與胎牛血清購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol與Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；miR-486-5p模擬物(mimics)及陰性對(duì)照 mimic NC 序列(miR-NC)、TRPM2小干擾RNA(si-TRPM2)及亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3Ⅱ、LC3Ⅰ抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗人線粒體融合蛋白(Mfn)2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人核呼吸因子(NRF)1多克隆抗體購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；兔抗人TRPM2抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)3抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)BIOWORLD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體購(gòu)自南京中洪博元生物科技有限公司；熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建PD模型 SK-N-SH細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用100 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞24 h，建立PD細(xì)胞模型〔8〕。

1.2.2實(shí)驗(yàn)處理及分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)置Con組(未經(jīng)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞)、MPP+組(100 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞24 h)，檢測(cè)兩組SK-N-SH細(xì)胞中miR-486-5p、TRPM2的表達(dá)水平。為探究miR-486-5p表達(dá)變化對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞自噬及凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)置MPP++miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h)、MPP++miR-486-5p組(miR-486-5p mimics轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h)。為探究TRPM2表達(dá)變化對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞自噬及凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)置MPP++si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h)、MPP++si-TRPM2組(si-TRPM2轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h)。為探究miR-486-5p是否調(diào)控TRPM2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h)、miR-486-5p組(miR-486-5p mimics轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h)、anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h)、anti-miR-486-5p組(anti-miR-486-5p轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h)，采用Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRPM2蛋白表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置MPP++miR-486-5p+pcDNA組(miR-486-5p mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h)、MPP++miR-486-5p+pcDNA-TRPM2組(miR-486-5p mimics與pcDNA-TRPM2共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中miR-486-5p、TRPM2 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取SK-N-SH細(xì)胞總RNA，利用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-486-5p正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TRPM2正向引物為5′-AAGTACGTCCGAGTCTCCCA-3′，反向引物為：5′-CGGAAAATGCTCTTCAGCCG-3′；GAPDH正向引物為5′-CTGAAGAGCTGCTTCACCAA-3′，反向引物為：5′-ATGGTGCTGTCCTTGACAAC-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。置于ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-486-5p、TRPM2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組SK-N-SH細(xì)胞，0.25%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞3次，每次5 min，加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，室溫條件下加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，充分混勻，于1 h內(nèi)置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-486-5p的靶基因 TargetScan預(yù)測(cè)顯示TRPM2的3′UTR區(qū)存在miR-486-5p的持續(xù)性結(jié)合位點(diǎn)，利用基因突變技術(shù)將集合位點(diǎn)進(jìn)行突變，分別將結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)分別載入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-TRPM2與突變型載體MUT-TRPM2，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-N-SH細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組：WT-TRPM2+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-TRPM2+miR-486-5p mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-TRPM2+miR-NC共轉(zhuǎn)染組、MUT-TRPM2+miR-486-5p mimics共轉(zhuǎn)染組，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6Western印跡檢測(cè)Mfn2、NRF1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、TRPM2蛋白表達(dá) 收集各組SK-N-SH細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，加入RIPA裂解液裂解完全，收集上清液(細(xì)胞總蛋白)，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃搖床內(nèi)孵育24 h，室溫條件下加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影，定影，應(yīng)用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-486-5p和TRPM2在MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組相比，MPP+組SK-N-SH細(xì)胞中miR-486-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TRPM2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 TRPM2蛋白表達(dá)

表1 miR-486-5p和TRPM2在MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 MPP++miR-486-5p組SK-N-SH細(xì)胞中miR-486-5p的表達(dá)水平顯著高于MPP++miR-NC組(P<0.05)，提示成功上調(diào)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中miR-486-5p的表達(dá)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與Con組相比，MPP+組SK-N-SH細(xì)胞中Mfn2、NRF1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化；相較于MPP++miR-NC組，MPP++miR-486-5p組SK-N-SH細(xì)胞中Mfn2、NRF1蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2、表2。

1～4：Con組、MPP+組、MMP++miR-NC組、MPP++miR-486-5p組；圖3同

表2 miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，MPP+組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；相對(duì)于MPP++miR-NC組，MPP++miR-486-5p組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖3、圖4。

表3 miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

2.4干擾TRPM2表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 MPP++si-TRPM2組SK-N-SH細(xì)胞中TRPM2蛋白表達(dá)量較MPP++si-NC組顯著降低(P<0.05)，提示成功降低MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中TRPM2的高表達(dá)。相較于MPP++si-NC組，MPP++si-TRPM2組SK-N-SH細(xì)胞中Mfn2、NRF1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4、圖5。

圖3 Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved-caspese3蛋白表達(dá)

圖4 miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

表4 干擾TRPM2表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1～4:Con組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-TRPM2組；圖6同

2.5干擾TRPM2表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響 與MPP++si-NC組相比，MPP++si-TRPM2組SK-N-SH細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6、表5。

圖6 TRPM2和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6miR-486-5p靶向調(diào)控TRPM2的表達(dá) Targetscan預(yù)測(cè)顯示TRPM2的3′UTR中含有與miR-486-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖7。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT-TRPM2 miR-NC組相比，(WT-TRPM2)miR-486-5p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與MUT-TRPM2 miR-NC組相比，(MUT-TRPM2)miR-486-5p組熒光素酶活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表6。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組(0.41±0.04)比較，miR-486-5p組SK-N-SH細(xì)胞中TRPM2蛋白表達(dá)量顯著降低(0.22±0.02，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.39±0.04)比較，anti-miR-486-5p組SK-N-SH細(xì)胞中TRPM2蛋白表達(dá)量顯著升高(0.85±0.08，P<0.05)，見(jiàn)圖8。表明miR-486-5p可靶向調(diào)控TRPM2的表達(dá)。

2.7TRPM2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用 相對(duì)于MPP++miR-486-5p+pcDNA組，MPP++miR-486-5p+pcDNA-TRPM2組SK-N-SH細(xì)胞中Mfn2、NRF1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SK-N-SH細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖9、表7。

表5 干擾TRPM2表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

圖7 TRPM2的3′UTR中含有與miR-486-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組、miR-486-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-486-5p組

1～4：MPP+ miR-NC組、MPP+ miR-486-5p組、MPP+ miR-486-5p+pcDNA組、MPP+ miR-486-5p+pcDNA-TRPM2組

表7 TRPM2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中線粒體相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

miRNA在PD患者腦組織中異常表達(dá)，并可在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究表明神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、自噬與PD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miRNA可通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與自噬從而參與PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔9，10〕。既往研究報(bào)道顯示用MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞建立PD模型〔11〕。本研究通過(guò)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型，探尋新型miRNA的表達(dá)變化及其在PD發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制。

miR-486-5p在膝骨關(guān)節(jié)炎患者中呈低表達(dá)，其表達(dá)量與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔12〕。相關(guān)報(bào)道指出miR-486-5p通過(guò)靶向Smad2抑制TGF-β2誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞增殖、侵襲〔13〕。但miR-486-5p在PD發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果顯示，MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中miR-486-5p的表達(dá)水平顯著降低，提示miR-486-5p表達(dá)下調(diào)可能參與PD發(fā)生過(guò)程。NRF1作為轉(zhuǎn)錄因子，可參與線粒體生物合成及呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程，抑制NRF1表達(dá)可促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Mfn2是一種線粒體融合基因，研究報(bào)道指出Mfn2過(guò)表達(dá)可保護(hù)線粒體免受損傷從而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞〔14，15〕。本研究結(jié)果顯示MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中Mfn2、NRF1蛋白表達(dá)量顯著下降，而miR-486-5p過(guò)表達(dá)可明顯提高M(jìn)fn2、NRF1蛋白表達(dá)量，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)可降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞自噬水平。研究表明LC3屬于自噬相關(guān)蛋白，其中LC3Ⅱ是LC3Ⅰ的裂解形式，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高表示自噬活躍，檢測(cè)LC3Ⅱ水平可反映自噬的強(qiáng)弱〔16〕。本研究結(jié)果顯示MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明MPP+可提高SK-N-SH細(xì)胞自噬活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-486-5p過(guò)表達(dá)可明顯降低LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞模型的自噬活性具有明顯的抑制作用。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡率顯著升高，但miR-486-5p過(guò)表達(dá)可明顯降低MPP+造成的高凋亡率，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞模型的凋亡具有明顯的抑制作用。研究報(bào)道指出Bcl-2蛋白屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，細(xì)胞接收凋亡信號(hào)時(shí)，Bax可促使線粒體凋亡因子釋放激活caspase3形成cleaved-caspase3進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明SK-N-SH細(xì)胞發(fā)生自噬的同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，但miR-486-5p過(guò)表達(dá)后SK-N-SH細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)降低，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)及下調(diào)Bax、cleaved-caspase3的表達(dá)從而抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡。但線粒體自噬與凋亡在PD發(fā)生過(guò)程中的相關(guān)性及其可能的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

TRPM2屬于細(xì)胞膜上的非選擇性陽(yáng)離子通道，研究表明TRPM2在腦組織中呈高表達(dá)，并可調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)進(jìn)而參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔18〕。研究報(bào)道指出丁基苯酚可能通過(guò)下調(diào)TRPM2的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞損傷從而對(duì)慢性缺血性腦組織神經(jīng)發(fā)揮保護(hù)作用〔19〕。本研究結(jié)果顯示MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中TRPM2的表達(dá)水平顯著升高，干擾TRPM2的表達(dá)可抑制SK-N-SH細(xì)胞凋亡，提高M(jìn)fn2、NRF1的表達(dá)水平，降低LC3Ⅱ的表達(dá)水平，提示干擾TRPM2的表達(dá)可降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞自噬活性。進(jìn)一步研究顯示干擾TRPM2的表達(dá)可降低SK-N-SH細(xì)胞凋亡率，抑制Bax、cleaved-caspase3的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，提示干擾TRPM2的表達(dá)可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而抑制PD模型細(xì)胞的凋亡。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與Western印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-486-5p可靶向調(diào)控TRPM2的表達(dá)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TRPM2過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)了miR-486-5p過(guò)表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞線粒體相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的作用。提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)下調(diào)靶基因TRPM2的表達(dá)從而抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡及自噬。

綜上所述，miR-486-5p在PD細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)，而TRPM2表達(dá)上調(diào)，miR-486-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制TRPM2的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡及自噬從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，可為PD的基因治療提供新方向。但本研究?jī)H在體外驗(yàn)證miR-486-5p過(guò)表達(dá)與PD模型細(xì)胞自噬、凋亡的關(guān)系，關(guān)于其在體內(nèi)是否具有相同的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。