ESTD術(shù)聯(lián)合生物免疫療法對老年食管癌患者療效及循環(huán)腫瘤細(xì)胞的影響

李維青 李志田 張旭剛 李寶重 劉揆亮

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 1胸外科，北京 100038；2消化科)

食管癌是全世界第八位最常見腫瘤，同時也是造成癌癥患者死亡的常見原因，僅于2012年，大約有45萬例食管癌新增患者，有40萬例患者死于該病，而外科手術(shù)被認(rèn)為是局限性食管癌患者的首選治療方法〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，隧道法內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(ESTD)可以通過內(nèi)鏡在食管黏膜下建立起固有肌層和黏膜層間的通道，封閉了消化管腔與其他腔隙，通過通道進(jìn)行手術(shù)操作，并發(fā)癥發(fā)生率低。生物免疫療法可以通過抑制癌細(xì)胞的增殖及增強(qiáng)患者免疫力達(dá)到增強(qiáng)治療效果的作用，是一種重要的腫瘤輔助治療手段，然而有關(guān)該療法在食管癌中應(yīng)用的研究并不多見。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)已被證明是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素，可為癌癥治療提供新的策略，高CTC與腫瘤患者整體生存率差有關(guān)〔3〕。本研究探討ESTD及ESTD聯(lián)合生物免疫療法對老年食管癌患者療效及對CTCs的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 將首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院于2014年8月至2019年2月收治的117例老年食管癌患者作為研究對象，隨機(jī)分為對照組(n=58)和觀察組(n=59)。對照組男34例，女24例；年齡65～74歲，平均(69.27±1.40)歲；病變部位在頸段、胸上段、胸中段、胸下段的患者例數(shù)分別為8、11、32、7例。觀察組男37例，女22例；年齡65～75歲，平均(69.48±1.32)歲；病變部位在頸段、胸上段、胸中段、胸下段的患者例數(shù)分別為6、10、28、15例。兩組性別、年齡、腫瘤病灶的位置比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，本研究已獲取醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為食管癌；臨床資料完整；患者均具有手術(shù)指征；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他部位的惡性腫瘤；有心、肝等重要器官衰竭；患者及其家屬配合度欠佳；合并精神異常者；合并有血液系統(tǒng)疾病。

1.2方法 對照組接受ESTD治療，在患者麻醉成功后采用盧戈液確定病變的部位及范圍，在腫瘤病灶邊緣3～5 mm處進(jìn)行標(biāo)記，隨后進(jìn)行多點(diǎn)注射，形成局部隆起，應(yīng)用一次性黏膜切開刀(Dualknife)沿事先做好的標(biāo)志部位切開直至黏膜下層，經(jīng)切口進(jìn)入，將固有肌層和黏膜層分離，建立黏膜下隧道，內(nèi)鏡沿隧道兩側(cè)對病灶進(jìn)行切除，直至完成整個病灶的切除，采用氬離子凝固術(shù)及熱活檢鉗處理出血的小血管。術(shù)后給予患者抑酸、補(bǔ)液和營養(yǎng)支持等對癥治療。觀察組接受ESTD聯(lián)合生物免疫療法治療，手術(shù)方式同上，采集患者外周血100 ml，應(yīng)用聚蔗糖(Ficoll)將外周血單個核細(xì)胞分離，洗滌、離心后進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的活化。將培養(yǎng)8～10 d的細(xì)胞通過離心、洗滌，并就部分細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌感染的檢測，確定滿足細(xì)胞質(zhì)量控制的要求后按照(6～8)×108/次的量將細(xì)胞溶于100 ml的生理鹽水，在2 h之內(nèi)將其回輸至患者體內(nèi)，1次/d，連續(xù)輸入5次。

1.3臨床療效 根據(jù)實(shí)體瘤臨床分級標(biāo)準(zhǔn)于治療結(jié)束后對所有患者進(jìn)行臨床療效評估，完全緩解(CR)是指病灶均消失，且在4 w之內(nèi)無復(fù)發(fā)；部分緩解(PR)是指腫瘤病灶縮小超過50%，同時沒有新的腫瘤病灶產(chǎn)生；穩(wěn)定(SD)是指腫瘤病灶縮小面積在50%之內(nèi)，增大量小于10%；進(jìn)展(PD)是指病灶無縮小反而增大，增大面積超過10%，甚至有新病灶產(chǎn)生。將前兩者規(guī)定為臨床緩解。

1.4血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平 在所有患者治療前和治療后采集患者肘靜脈血約5 ml，離心獲取血清，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法就血清腫瘤相關(guān)細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)、癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC)、糖類抗原(CA)19-9水平進(jìn)行測定。采用美國曼貝克曼發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行操作，試劑盒由北京科美生物技術(shù)有限公司提供。

1.5免疫功能指標(biāo) 分別于治療前、后采集患者肘靜脈血約3 ml于抗凝管中，加入10 μl的CD3+、CD4+、CD8+抗體，避光孵育0.5 h后加200 μl的溶血素，避光放置15 min。待溶液變?yōu)橥该骱?，加? ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心，隨后應(yīng)用多聚甲醛溶液固定，檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平，并計(jì)算出對應(yīng)的CD4+/CD8+，采用美國BD公司所生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀及對應(yīng)試劑進(jìn)行操作。

1.6CTCs表達(dá)情況〔4〕于治療前、后采集患者肘靜脈血約5 ml，將紅細(xì)胞去除后，使用Militenyi免疫磁珠將白細(xì)胞去除并富集上皮來源的細(xì)胞，對CTCs表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，采用免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)行鑒定。CTCs超過3個為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.7術(shù)后并發(fā)癥 記錄所有患者住院期間所發(fā)生的并發(fā)癥，如：食管反流、發(fā)熱等，并給予對癥處理。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床療效比較 對照組臨床緩解率(70.69%，CR 22例、PR 19例、SD 13例、PD 4例)顯著低于觀察組(89.83%，CR 32例、PR 2例、SD 5例、PD 1例；χ2=6.779,P=0.009)。

2.2兩組治療前后血清腫瘤標(biāo)志物水平比較 治療前，兩組血清Cyfra21-1、CEA、SCC、CA19-9表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；治療后，兩組以上血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平顯著下降，觀察組顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組治療前后血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平比較

2.3兩組治療前后免疫功能指標(biāo)比較 治療前，兩組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；治療前后兩組CD8+比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，治療后，兩組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表達(dá)水平顯著下降，觀察組顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

2.4兩組治療前后CTCs表達(dá)比較 治療前，兩組CTCs陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；治療后，兩組CTCs陽性表達(dá)率均下降，觀察組低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組治療前后CTCs陽性表達(dá)率比較〔n(%)〕

2.5兩組術(shù)后并發(fā)癥比較 住院期間，對照組有4例(6.90%)患者發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥，2例為食管反流，1例為發(fā)熱，1例為創(chuàng)口感染；觀察組有6例(10.17%)患者發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥，3例為食管反流，3例為發(fā)熱。兩組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)抗感染等對癥支持治療，患者均逐漸恢復(fù)。

3 討 論

對于中晚期食管癌患者的治療以非手術(shù)方法包括放射療法和聯(lián)合治療為主，盡管在過去的幾十年間，食管癌的放射治療和外科診斷技術(shù)都取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，晚期食管癌患者的預(yù)后仍然很差，目前認(rèn)為，腫瘤進(jìn)展通常伴有免疫功能差，患者免疫系統(tǒng)功能在影響腫瘤的療效方面具有重要作用，而T細(xì)胞免疫功能減弱導(dǎo)致患者的免疫反應(yīng)發(fā)生變化可能是造成食管癌預(yù)后差的關(guān)鍵性因素〔5,6〕。生物免疫療法是腫瘤治療過程中的重要輔助治療方法，有助于改善腫瘤患者炎癥反應(yīng)狀態(tài)，提高患者免疫功能〔7〕。

Cyfra21-1是上皮細(xì)胞角蛋白19片段中的可識別部分，存在于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，構(gòu)成了食管癌腫瘤細(xì)胞骨架，在食管癌進(jìn)展過程中，上皮細(xì)胞角蛋白在酶的作用下發(fā)生降解，通過外分泌釋放入血，引起Cyfra21-1的表達(dá)水平升高；CEA是消化道腫瘤的常見的腫瘤標(biāo)志物，同時也是一種可溶性蛋白復(fù)合體，發(fā)生腫瘤時，組織間連接的破壞及腫瘤細(xì)胞表面抗原附著力的改變會造成相關(guān)抗原釋放入血，CEA表達(dá)量升高；SCC可作為診斷食管鱗癌的指標(biāo)；CA19-9屬于糖蛋白超家族成員，可隨著腫瘤細(xì)胞的異常分化產(chǎn)生量增加，并在食管癌細(xì)胞死亡后釋放入血〔8,9〕。以上血清學(xué)指標(biāo)均可伴隨著食管癌的進(jìn)展過程而發(fā)生改變。

ESTD與傳統(tǒng)的內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)(ESD)相比具有許多技術(shù)優(yōu)勢，包括：可以通過在黏膜層和肌層之間形成黏膜下隧道來切除黏膜病變，隨后治療性內(nèi)窺鏡可以進(jìn)入隧道并獲得清晰的手術(shù)視圖，手術(shù)中注入的二氧化碳可以幫助鈍性解剖黏膜層，減少黏膜下注射次數(shù)，縮短手術(shù)時間，提高切除速度，減少肌層損傷等，可以更徹底地切割黏膜下層，從而降低腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險〔10,11〕。而生物免疫療法中DC細(xì)胞具有攝取、加工和呈遞抗原的作用，可以促使T細(xì)胞的活化；而CIK細(xì)胞則具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，回輸 DC和CIK細(xì)胞有助于對惡性腫瘤的治療〔12〕。因此，ESTD術(shù)聯(lián)合生物免疫療法對食管癌患者的治療效果更好，也更能促使高表達(dá)的血清腫瘤標(biāo)志物水平的恢復(fù)。

CTCs是離開原發(fā)腫瘤部位并進(jìn)入血流的腫瘤細(xì)胞，可以擴(kuò)散到其他器官，而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移可能是由CTCs引發(fā)的臨床隱匿性微小殘留病灶引起的，CTCs可能具有轉(zhuǎn)移的潛力，其對腫瘤預(yù)后的評判價值已在多種腫瘤中得到證實(shí)，一項(xiàng)meta分析結(jié)果也肯定了CTCs在監(jiān)測食管癌患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后中的作用〔13〕。本研究結(jié)果提示聯(lián)合治療方案對降低CTCs陽性率有較好的效果，這可能與觀察組加用了生物免疫療法，生物免疫療法中DC的回輸可促使處于靜止?fàn)顟B(tài)的T淋巴細(xì)胞被激活，激活免疫系統(tǒng)，促使機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)；CIK細(xì)胞的殺傷活性水平較高，且并不會被T細(xì)胞受體所影響，具有顯著的抗腫瘤作用〔14～16〕，DC-CIK療法可改善腫瘤患者免疫功能，增強(qiáng)治療效果有關(guān)。翟軍厚等〔17〕指出，生物免疫療法的應(yīng)用可有效降低外周血CTCs水平，與本研究結(jié)果一致。而兩組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率的比較提示生物免疫療法的應(yīng)用安全可靠，并不會顯著增加不良反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，ESTD聯(lián)合生物免疫療法對老年食管癌患者治療效果確切，可有效降低CTCs、血清腫瘤標(biāo)志物水平，改善患者免疫功能。