乙型肝炎病毒剪接特異性蛋白在乙肝病毒感染相關(guān)肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

孫龍 蘇健 鄧楊柳 黃圣楷 符微

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科，海南 ?？?570102)

肝細(xì)胞癌(HCC)在全球惡性腫瘤發(fā)病率中列第6位，每年新發(fā)的HCC及其死亡病例有50%以上發(fā)生在中國〔1〕，中國HCC發(fā)病率居惡性腫瘤第4位，病死率居惡性腫瘤第3位〔2〕。乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起HCC的最主要原因，超過80%的HCC與HBV感染相關(guān)〔3〕。HCC早期癥狀多不明顯，臨床診斷困難，病人就診時(shí)往往已是進(jìn)展期，甚至全身廣泛轉(zhuǎn)移，已錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后差。因此，尋找特異性好、診斷價(jià)值高的標(biāo)志物及有效的治療靶點(diǎn)，是目前研究HCC的主要熱點(diǎn)之一。乙型肝炎病毒剪接特異性蛋白(HBSP)在慢性HBV感染患者中十分常見，可影響肝細(xì)胞功能，具有重要的致病意義〔4〕。本研究觀察HBSP在HBV感染肝臟疾病中的表達(dá)變化，并探討其對HCC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1病例資料 選取2018年7月至2019年12月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診及療區(qū)的HBV感染相關(guān)疾病患者152例，其中慢性HBV攜帶者(CHBC)40例，男23例，女17例，平均年齡(38.8±15.2)歲；慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者42例，男30例，女12例，平均年齡(43.8±10.6)歲；肝硬化(LC)患者38例，男27例，女11例，平均年齡(48.5±12.7)歲；HCC患者32例，男25例，女7例，平均年齡(45.6±16.2)歲。所有患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》、《原發(fā)性肝癌防治指南(2011年版)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，就診前均未接受抗HBV治療，性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2分析方法 靜脈采血、分離血清，采用熒光定量檢測HBV-DNA水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測甲胎蛋白(AFP)、AFP異質(zhì)體(AFP-L3)、AFP-L3%水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測HBSP水平。病毒DNA提取試劑盒，QIAamp MinElute Virus Spin產(chǎn)品；HBSP上游引物：CCGCGTCGCAGAAGATCT；下游引物：ATGGGAATACAGGTGCAATTTCC和HBSP標(biāo)準(zhǔn)品(HBSP全長506 bp)引物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成并純化。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測HBSP：取200 μl血清樣本，使用病毒DNA提取試劑盒提取血清病毒 DNA作為模板，采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法實(shí)時(shí)定量PCR專用試劑TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(KaTaRa，日本)，用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系為25 μl：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl、上游引物和下游引物(20 pmol/L)各1 μl、DNA模板2 μl和8.5 μl滅菌超純水。擴(kuò)增條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 10 s，39個(gè)循環(huán)，熔解曲線繪制從 65℃到 95℃。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線、熔解曲線并記錄Cq值，進(jìn)行檢測方法學(xué)評估及實(shí)驗(yàn)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0及 GraphPad Prism6 軟件行單因素方差分析、Kruskal-WallisH檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清HBSP水平(cq值)比較 與CHBC組(29.81±5.34)比較，CHB組(31.74±5.66)、LC組(34.73±4.11)及HCC組(39.94±3.79)組血清HBSP的Cq值均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，HCC組>LC組>CHB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2各組HBV-DNA水平比較 與CHBC組(7.35±0.48 log10IU/ml)比較，CHB組(4.34±0.35 log10IU/ml)、LC組(4.57±0.24 log10IU/ml)及HCC組(4.39±0.21 log10IU/ml)血清HBV-DNA水平均明顯降低(P<0.01)，LC、HCC組血清HBV-DNA水平明顯低于CHB組(P<0.05)，而兩組LC、HCC無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3各組血清AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較 血清AFP水平方面，與CHBC組比較，HCC組、CHB組及LC組均明顯升高(P<0.05,P<0.01)，且HCC組>CHB組>LC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，但HCC組AFP水平相差較大，部分患者完全正常。血清AFP-L3、AFP-L3%水平方面，與CHBC組比較，LC組升高(P<0.05)，而HCC組明顯升高(P<0.01)，且明顯高于CHB、LC組(P<0.01)，見表1。

表1 各組血清AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較

2.4相關(guān)性分析 各組血清HBSP水平與血清HBV-DNA、AFP無明顯相關(guān)性(P>0.05)，與AFP-L3、ALP-L3%水平呈一定效應(yīng)關(guān)系，呈正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 血清HBSP水平與HBV-DNA、AFP、AFP-L3、AFP-L3%相關(guān)性(r/P值)

3 討 論

目前，針對HCC臨床診斷、早期篩查臨床上應(yīng)用最為廣泛的AFP在轉(zhuǎn)錄水平上受多種因素調(diào)控，CHB、LC患者也可出現(xiàn)低-中度升高，而部分低分化型HCC患者正常，其特異性并不理想。AFP-L3僅由肝癌細(xì)胞分泌產(chǎn)生，與影像學(xué)比較，對HCC早期診斷有9～12個(gè)月提前時(shí)間〔5〕，血清AFP-L3%、AFP-L3陽性率與癌灶大小、腫瘤分期呈正相關(guān)，對于判斷HCC的腫瘤病理學(xué)特性具有一定意義〔6〕，在AFP濃度<200 ng/ml時(shí)，AFP-L3%對HCC的確診具有重要的臨床意義〔7〕。維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導(dǎo)蛋白(PIVKA-Ⅱ)是診斷HCC的另一個(gè)重要指標(biāo)，可與AFP互補(bǔ)〔8〕，聯(lián)合AFP可提高HCC檢出率，且在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中有一定的優(yōu)勢，可用于監(jiān)測病情變化〔9〕。但由于多種條件限制，AFP-L3、AFP-L3%及PIVKA-Ⅱ在臨床實(shí)際工作開展并不多，目前對于HCC的臨床診斷仍然主要依賴于AFP、影像學(xué)和肝活檢，尚缺乏具有高度特異性的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)，早期臨床診斷依舊相對比較困難。眾所周知，慢性HBV感染是LC、HCC最主要原因，我國77.22%的LC患者由HBV感染引起〔10〕，超過84%的HCC患者與HCC相關(guān)〔11〕。早期研究認(rèn)為，HBV基因變異是CHB病程發(fā)展方向的重要決定因素〔12〕。HBV基因組剪接變異體與HBV的持續(xù)性感染和致病性存在密切關(guān)系〔13～15〕。HBSP可影響肝細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝等方面，與肝細(xì)胞的增生、遷移及代謝異常密切相關(guān)，可能在HBV感染發(fā)病機(jī)制中具有重要作用〔16〕。在HCC確診前HBSP有明顯增加，提示血清HBSP或許可以成為一個(gè)預(yù)測HCC發(fā)生的有效手段〔17〕。另有研究結(jié)果提示，HBSP介導(dǎo)的HCC細(xì)胞或原代人肝細(xì)胞(PHH)對激動(dòng)性抗Fas抗體(CH11)或FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抗性，表明HBSP通過增強(qiáng)PI3K/Akt活性來防止Fas誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，可能有助于慢性感染過程中被感染肝細(xì)胞的存活和持久性〔18〕。

本研究結(jié)果提示HBV引起的反復(fù)免疫應(yīng)答反應(yīng)致HBV-DNA低表達(dá)，不能完全清除或有效抑制HBV，肝臟炎癥反復(fù)發(fā)生，是肝細(xì)胞損傷的主要機(jī)制，是進(jìn)展為LC、 HCC 的重要因素。AFP影響因素較多，肝臟炎癥明顯時(shí)肝細(xì)胞再生可致血清AFP 升高，而部分低分化型HCC血清AFP正常，臨床診斷HCC的特異性下降。血清AFP-L3、AFP-L3%對于HCC更具臨床診斷意義，與相關(guān)報(bào)道一致〔5～7〕。另外，本研究結(jié)果提示HBSP與HBV感染相關(guān)肝臟疾病關(guān)系密切，可能是HCC獨(dú)立影響因素，具有一定的臨床診斷價(jià)值。

綜上，HBSP水平在HBV感染相關(guān)HCC中表達(dá)升高，在其發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用，特別是對HCC的臨床診斷、早期篩查或許具有重要意義。至于HBSP參與HBV感染相關(guān)肝臟疾病(特別是HCC)的確切機(jī)制，能否成為HCC新的、特異性好、診斷價(jià)值高的檢測指標(biāo)，或成為HCC有效的治療靶點(diǎn)，還有待進(jìn)一步研究。