循環(huán)游離DNA在乳腺癌中的應(yīng)用及進(jìn)展

舒準(zhǔn)，周炳娟，張金庫，韓宇星

(1.承德醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 承德 067000；2.保定市第一中心醫(yī)院病理科，河北 保定 071000)

0 引言

乳腺癌(BC)是世界第二大流行疾病，僅次于肺癌，僅2018年新增約210萬例。它也是女性中最常見的癌癥和第二大死因，占所有癌癥的25.1%[1-3]。從21世紀(jì)初，乳腺癌流行已被認(rèn)為是特有的新趨勢。由于其性質(zhì)的復(fù)雜性，乳腺癌有效的治療可能會遇到許多挑戰(zhàn)。雖然根治手術(shù)、放射治療和藥物治療大大降低了乳腺癌患者復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提高了患者的總存活率，但仍有一定比例的患者出現(xiàn)早期腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展[4,5]。

乳腺癌通常根據(jù)腫瘤的分子結(jié)構(gòu)分為不同的亞型[6]。乳腺癌的一種亞型是雌激素受體陽性(ER+)/孕激素受體陽性(PR+)，通常被認(rèn)為是一種對內(nèi)分泌治療有反應(yīng)的腫瘤[7,8]。第二個(gè)亞型是HER2+陽性的人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor positive，HER2+)乳腺腫瘤，以HER2癌基因過表達(dá)為特征，可以使用曲妥珠單抗進(jìn)行治療。三陰性腫瘤是乳腺癌的另一種亞型，腫瘤內(nèi)缺乏ER、PR和HER2的陽性表達(dá)。這種亞型死亡率很高，并且對某些藥物治療方法沒有反應(yīng)[9]。除個(gè)體間多樣性外，乳腺腫瘤具有較高的瘤內(nèi)異質(zhì)性，在治療選擇中起著重要作用[10]。因此，解決乳腺腫瘤異質(zhì)性的理想方法是找到一種能夠捕獲腫瘤整個(gè)遺傳圖譜的方法。收集腫瘤的連續(xù)活檢和縱向監(jiān)測是捕獲腫瘤系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)展的必要條件。然而，僅僅通過組織活檢來做這些手術(shù)是不可行的，因?yàn)樗鼈兪乔秩胄缘模赡苁遣蝗娴?。使用新開發(fā)的液體活檢方法可以徹底地篩查乳腺癌的不同分子結(jié)構(gòu)[11,12]。分析液體活檢的高靈敏度技術(shù)使得腫瘤患者的連續(xù)活檢成為可能[13]。此外，這種新方法解決了腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性問題，并彌補(bǔ)了目前采用的方法如組織活檢的缺點(diǎn)。

1 cfdna來源及特征

循環(huán)游離DNA(cfDNA)是1948年由Mandel和Metais[14]首次發(fā)現(xiàn)的在血漿、血清和細(xì)胞外其他體液中循環(huán)的核酸片段。1977年Leon等[15]在乳腺癌患者的血清中檢測到不同濃度的cfDNA(從0到2μg/mL)。Duque-Afonso等人發(fā)現(xiàn)大多數(shù)cfDNA片段的范圍在80bp到200bp之間[16]，通常以一種蛋白復(fù)合體的形式存在的DNA雙鏈片段。健康人中，cfdna主要來自于凋亡和壞死細(xì)胞，除此之外，健康細(xì)胞也可能主動釋放DNA片段[17]。cfDNA可以來自不同的地方，包括健康的組織，癌癥組織以及胎兒。在一些身體機(jī)能發(fā)生變化，如癌癥、炎癥、自身免疫性疾病、吸煙、懷孕甚至劇烈運(yùn)動，以及放射或手術(shù)治療等等，都可以引起血液中cfDNA濃度的變化[18-22]。在血液中，cfDNA濃度可能從健康人的13ng/mL到癌癥晚期的大約180ng/mL不等。一般而言，cfDNA在細(xì)胞的日常功能中表現(xiàn)出來，例如在外泌體中的排泄和運(yùn)輸，或者在凋亡和壞死期間?？梢栽谌魏误w液(血液、唾液、淚液、尿液、汗液、羊水、腦脊液和胸水、宮頸陰道分泌物和傷口滲出物等)中可以檢測到cfDNA，并且可以在體外進(jìn)行分析感興趣的目標(biāo)特征[23]。cfDNA在健康患者中存活16分鐘至2.5小時(shí)，其濃度在健康患者中由于活性核酸降解而顯著低于惡性腫瘤患者。這就意味著，通過cfDNA濃度的變化可以對一些癌癥進(jìn)行診斷和監(jiān)測。但是，cfDNA的半衰期很短，不到2小時(shí)，可以通過肝臟和腎臟清除[24]。腎功能不全會影響cfDNA清除率，這可能是調(diào)節(jié)某些癌癥患者cfDNA濃度的一個(gè)混雜因素。cfDNA檢測是一種在分子水平上檢測腫瘤的新方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 cfdna臨床應(yīng)用

cfDNA分析提供了檢測微小殘留病和監(jiān)測復(fù)發(fā)的機(jī)會，這可能有助于改善患者的管理和預(yù)后。Tie等人報(bào)道稱，cfDNA分析可能有助于檢測最小的殘留病，這表明基于突變cfDNA的檢測，有能力選擇癌癥患者進(jìn)行輔助治療[25]。Openshaw等人通過跟蹤腫瘤組織和胃食管腺癌患者相應(yīng)血漿樣本中的TP53突變頻率，研究了突變的cfDNA跟蹤腫瘤進(jìn)展和提供微小殘留病證據(jù)的能力[26]。Phallen等人的另一項(xiàng)研究。使用大規(guī)模平行測序來識別體細(xì)胞突變，作為大腸癌(CRC)患者的突變cfDNA標(biāo)記物，用于檢測微小殘留病，并監(jiān)測三年隨訪期內(nèi)腫瘤負(fù)擔(dān)的變化。在所有復(fù)發(fā)患者中都檢測到突變的cfDNA，但在未復(fù)發(fā)患者中未檢測到[27]。林等人評估了靈敏的54個(gè)癌癥基因數(shù)字NGS分析在黑色素瘤根治性手術(shù)切除后區(qū)域轉(zhuǎn)移患者中的應(yīng)用，該分析覆蓋了所有主要的黑色素瘤驅(qū)動基因[28]。在胃癌(GC)患者的血漿中，Ogino等人發(fā)現(xiàn)，ddPCR測定的HER2比率是檢測復(fù)發(fā)和實(shí)時(shí)評估HER2狀態(tài)以監(jiān)測HER2陽性胃癌患者治療效果的一種可重復(fù)的非侵入性方法[29]。

治療和耐藥性監(jiān)測顯然也是腫瘤學(xué)的一個(gè)挑戰(zhàn)。自從L.Diaz和Bardelli的小組以前的開創(chuàng)性工作[30-32]證明腫瘤中出現(xiàn)耐藥克隆導(dǎo)致靶向治療耐藥以來，cfDNA分析也成為檢測治療過程中早期耐藥的潛在工具。

3 cfdna與乳腺癌

乳腺癌的早期診斷是降低癌癥相關(guān)死亡率的關(guān)鍵，但其重要性因疾病類型和級別的不同而不同。對于II級和III級乳腺癌，進(jìn)展要比I級癌癥快得多。早期乳腺癌是可以被治愈的，因此，如果在腫瘤在小于2厘米的情況下早期診斷，這些患者的總體生存和預(yù)后可以得到極大的改善，但是這種在患者未出現(xiàn)癥狀時(shí)，對其進(jìn)行檢測時(shí)具有挑戰(zhàn)性的[33]。乳腺癌的早期檢測也有助于選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ê洼o助治療，因此增加了解決的機(jī)會。多項(xiàng)研究已經(jīng)檢驗(yàn)了循環(huán)游離DNA在乳腺癌癥狀前早期檢測的可能性[34-36]。Beaver等人的一項(xiàng)研究報(bào)道了使用ddPCR準(zhǔn)確檢測到PIK3CA基因的突變[36]，他們發(fā)現(xiàn)15名患者的腫瘤中存在PIK3CA突變，其中14例是在匹配的術(shù)前cfDNA中檢測到的。術(shù)后對14例患者中的10例進(jìn)行了cfDNA檢測，其中5例(50%)術(shù)后仍可檢測到PIK3CA突變。由此可見，在早期乳腺癌患者中，可以使用ddPCR在手術(shù)前后檢測到cfDNA。同時(shí)，對于接受過腫瘤切除手術(shù)的癌癥患者。液體活檢可用于這些患者術(shù)后的cfDNA分析，以搜索微小殘留病(MRD)、任何可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)的切除手術(shù)后殘留的腫瘤成分，以及估計(jì)復(fù)發(fā)的機(jī)會[37]。切除的腫瘤樣本可以進(jìn)行分析，作為對每個(gè)人自身的縱向監(jiān)測的參考[38]。對于具有乳腺癌易感基因突變的高風(fēng)險(xiǎn)人群，使用液體活檢同樣可以使他們及早獲益[39-40]。然而，對于這種人群，通過液體活檢早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌的挑戰(zhàn)在于，他們確切的腫瘤突變特征尚不清楚，以便在他們的cfDNA中進(jìn)行搜索。正因?yàn)槿绱?，我們?yīng)該對大量已知的乳腺癌驅(qū)動基因進(jìn)行篩查，以提高敏感性。同時(shí)，對于cfDNA分析中可能發(fā)現(xiàn)的來源于非腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞致癌突變，我們應(yīng)該非常謹(jǐn)慎。未來的研究應(yīng)該集中在開發(fā)隨機(jī)體細(xì)胞突變率最低的乳腺癌致癌基因或突變小組，這些小組可以通過液體活檢在高危群體中，甚至在普通人群中早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌。以前的研究已經(jīng)證明，利用液體活檢來測量cfDNA水平，使我們能夠在臨床和放射檢查之前5個(gè)月就發(fā)現(xiàn)和診斷乳腺癌[41]。

4 展望

分子技術(shù)的最新進(jìn)展增強(qiáng)了液體活檢在乳腺癌治療中的潛在用途。近5年來，隨著NGS、ddPCR和分子條形碼等技術(shù)的發(fā)展，液體活檢在臨床上的應(yīng)用潛力得到了廣泛的研究。多項(xiàng)研究表明，使用液體活檢作為乳腺癌患者早期發(fā)現(xiàn)和縱向監(jiān)測的一種方法具有優(yōu)勢。同時(shí)cfDNA檢測是一種可重復(fù)的無創(chuàng)方式進(jìn)行的，這對于一些癌癥晚期患者可以多次檢測，并動態(tài)檢測腫瘤細(xì)胞的變化情況。乳腺癌的異質(zhì)性不僅導(dǎo)致取材的不全面性，而且產(chǎn)生藥物選擇上的一些問題，增加了對更個(gè)性化治療的需求，這些都可以通過液體來實(shí)現(xiàn)。并且還可以直接獲取腫瘤細(xì)胞的基因組的相關(guān)信息，可以用于指導(dǎo)后續(xù)的相關(guān)靶向治治療。

盡管研究已經(jīng)證明了液體活檢在乳腺癌治療中的有用性和利用率，但在它可以在臨床上常規(guī)使用之前，仍有幾個(gè)挑戰(zhàn)需要解決。例如，cfDNA的定量還不能用于乳腺癌檢測，因?yàn)樗拿舾卸群吞禺惗榷己艿?。因此，cfDNA中檢測到的基因改變需要與其水平變化相結(jié)合，并結(jié)合其他生物標(biāo)志物和成像技術(shù)來提高其敏感性和特異性。此外，還需要優(yōu)化cfDNA分離技術(shù)，以提高提取得率，并提高現(xiàn)有DNA分析技術(shù)在極低等位基因頻率下檢測ctDNA的靈敏度。最重要的是，在將其整合到臨床之前，還需要對cfDNA進(jìn)行進(jìn)一步的研究，特別是它的起源組織和生物學(xué)意義。總之，液體活檢有可能為乳腺癌的篩查和治療創(chuàng)造新的視野。然而，到今天為止，液體活檢最好作為二線診斷工具，建立在主要從經(jīng)典組織活檢獲得的結(jié)果的基礎(chǔ)上。需要進(jìn)一步的研究來克服目前這種方法的缺點(diǎn)，并為其在臨床環(huán)境中的應(yīng)用建立標(biāo)準(zhǔn)化的方案。