新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的性能驗(yàn)證

王亞飛，宋凌燕，馮都都，馬良，王晉霞，陳莎麗，史盟浩，李豪哲，曹慧媛，匡雪莉，紀(jì)愛(ài)芳

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院檢驗(yàn)科，山西 長(zhǎng)治 046000)

0 引言

新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起的肺炎從2019年底開(kāi)始廣泛傳播，并在全球蔓延，形勢(shì)十分嚴(yán)峻。COVID19已經(jīng)成為世界衛(wèi)生公共安全所要面對(duì)的問(wèn)題。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，新型冠狀病毒肺炎確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)為有流行病學(xué)史和臨床表現(xiàn)的疑似病例同時(shí)具備病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)之一者。常用的病原學(xué)證據(jù)即為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)2019-nCoV核酸陽(yáng)性[1]。為確保本室新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的可靠，根據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》(CNAS-CL02-A009)和《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》(CNAS-GL039)，對(duì)上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒在Lepgen-96全自動(dòng)醫(yī)用PCR儀上的性能驗(yàn)證，內(nèi)容包括方法符合率、檢出限、精密度、交叉反應(yīng)等[2-3]。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

健康體檢者咽拭子2019-nCoV核酸檢測(cè)陰性樣本。2019-nCoV RNA液體性能驗(yàn)證參考品(廣州邦德盛公司)，濃度為2.0×106copies/mL和2.0×105copies/mL的2019-nCoV RNA假病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)分別為GBW(E) 091133和GBW(E) 091132。陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒配套。

1.2 試劑和儀器

核酸提取試劑和EX3600全自動(dòng)核酸提取儀(上海之江生物科技股份有限公司)、新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑(上海伯杰醫(yī)療科技有限公司)、Lepgen-96全自動(dòng)醫(yī)用PCR儀(山東鑫貝西科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

按核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取，實(shí)時(shí)熒光RTPCR測(cè)定按核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)操作，用ORF1ab基因和N基因作為檢測(cè)靶基因。擴(kuò)增條件：50℃，15min；95℃，15min；94℃，15s，55℃，45s，40個(gè)循環(huán)。使用配套軟件(Real-Time PCR軟件v2.4)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)擴(kuò)增曲線，調(diào)整基線和熒光閾值，得到不同通道循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為FAM和VIC通道有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct≤40；陰性標(biāo)準(zhǔn)為FAM和VIC通道無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值＞40，且Cy5通道有擴(kuò)增曲線；如僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一條通道無(wú)擴(kuò)增曲線，則結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致可判為陽(yáng)性，復(fù)檢均為陰性則判為陰性。

1.4 性能驗(yàn)證方法

1.4.1 符合率

選用相同檢測(cè)方法的通過(guò)ISO15189認(rèn)可和衛(wèi)生健康委員會(huì)組織的2019-nCoV核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室作為參比實(shí)驗(yàn)室。選取陰陽(yáng)性樣本各6例，其中陰性樣本為健康體檢2019-nCoV核酸為陰性的樣本、陽(yáng)性樣本3例使用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒SARS-CoV2企業(yè)參考品2(濃度為5×103copies/mL，貨號(hào)：ZC-HX-201CKP2)進(jìn)行原倍、2倍、20倍稀釋，2例使用檢測(cè)試劑盒自帶陽(yáng)性對(duì)照品(濃度為1×105copies/mL)進(jìn)行原倍、100倍稀釋。1例使用廣州邦德盛生物科技有限公司生產(chǎn)的室內(nèi)質(zhì)控品S1(濃度為2.19×103批號(hào)為2020013)。按照患者樣本檢測(cè)程序與參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)，以參比實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為準(zhǔn)，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室與參比實(shí)驗(yàn)室的總符合率、陽(yáng)性符合率和陰性符合率。

1.4.2 檢出限

根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)聲明的檢出限為500copies/mL，使用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒SARSCoV2企業(yè)參考品2(濃度為5×103copies/mL，貨號(hào)：ZC-HX-201CKP2)進(jìn)行10倍稀釋后重復(fù)測(cè)定5次，100%檢出靶核酸，則檢出限驗(yàn)證合格。

1.4.3 交叉反應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)使用的分析特異性參考品為廣州中山達(dá)安公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。取一定濃度與待測(cè)核酸可能存在交叉反應(yīng)的病原體加入經(jīng)確認(rèn)為陰性的樣本中，與常規(guī)標(biāo)本一樣處理，至少重復(fù)檢測(cè)3次。判斷標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.4.4 精密度

檢測(cè)濃度為5.0×103copies/mL和5.0×105copies/mL的參考品，同一份樣本重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算各靶基因Ct值的變異系數(shù)，評(píng)價(jià)批內(nèi)不精密度。每份樣本重復(fù)測(cè)定2次，連續(xù)測(cè)定5天，計(jì)算各靶基因Ct值的變異系數(shù)，評(píng)價(jià)批間不精密度。判斷標(biāo)準(zhǔn)為符合說(shuō)明書(shū)聲明范圍批內(nèi)、批間CV均不大于5.0%則驗(yàn)證合格。

2 結(jié)果

2.1 符合率

本試劑檢測(cè)結(jié)果與參比實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)6例陽(yáng)性標(biāo)本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，6例陰性標(biāo)本均沒(méi)有Ct值，總符合率、陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為100%，符合率驗(yàn)證合格。

2.2 檢出限

在檢測(cè)下限驗(yàn)證中，本試劑盒對(duì)濃度為5.0×102copies/mL的2019-nCoV RNA陽(yáng)性樣本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，檢出率為100%。結(jié)果符合試劑說(shuō)明書(shū)聲明標(biāo)準(zhǔn)，檢出限驗(yàn)證合格。

2.3 交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)驗(yàn)證中檢測(cè)含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒、肺炎支原體、結(jié)核分枝桿菌樣本的2019-nCoV陰性樣本，重復(fù)3次的N基因及ORF1ab基因Ct值均＜40，結(jié)果均為2019-nCoV陰性。

2.4 精密度

重復(fù)性驗(yàn)證中5.0×105copies/mL 濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分別為0.53%和0.48%；5.0×103copies/mL 濃度水平的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為0.75%和0.61%。批間不精密度驗(yàn)證中5.0×105copies/mL 濃度的N基因和ORF1ab 基因的Ct值CV分別為1.98%和2.01%；5.0×103copies/mL濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV為1.41%和2.15%。CV符合試劑說(shuō)明書(shū)要求標(biāo)準(zhǔn)(＜5%)，精密度驗(yàn)證合格。

3 討論

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在核酸檢測(cè)中具有很高的靈敏度和特異度、高通量等優(yōu)點(diǎn)作為新型冠狀病毒肺炎的確診方法[4]，在快速診斷、疫情防控中發(fā)揮了及其重要作用。隨著新冠肺炎防治的常態(tài)化，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)也更加常規(guī)化。為確保本室新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的可靠，根據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》(CNAS-CL02-A009)和《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》(CNAS-GL039)，核酸檢測(cè)試劑進(jìn)入臨床使用前應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。

本研究所驗(yàn)證的核酸檢測(cè)試劑以2019-nCoV的ORF1ab和N基因設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針通過(guò)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)新冠病毒核酸的檢測(cè)。準(zhǔn)確度是指測(cè)量結(jié)果與真實(shí)結(jié)果之間的接近程度或一致性。本研究對(duì)6份陽(yáng)性質(zhì)控及6份陰性質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)值完全一致，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。精密度是在規(guī)定條件下，對(duì)同一被測(cè)對(duì)象多次重復(fù)測(cè)量所得結(jié)果的一致程度，通常以標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)表示。本研究顯示批內(nèi)精密度高濃度標(biāo)本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分別為0.53%和0.48%；低濃度標(biāo)本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為0.75%和0.61%。批間精密度高濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為1.98%和2.01%；低濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV為1.41%和2.15%。批內(nèi)精密度變異系數(shù)均在1%以內(nèi)，批間精密度變異系數(shù)均在3%以內(nèi)，符合廠家批內(nèi)批間精密度小于5%的聲明，說(shuō)明試劑性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。檢出限是指試劑對(duì)待測(cè)樣本的檢測(cè)能力，即靈敏度。驗(yàn)證試劑的靈敏度，即是對(duì)低濃度樣本(檢出限)的檢出率。本研究顯示樣本濃度在500copies/mL的時(shí)候在檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，滿足說(shuō)明書(shū)的檢測(cè)限，說(shuō)明該試劑具有足夠的檢測(cè)能力。最低檢出限是分子診斷產(chǎn)品的重要指標(biāo)，設(shè)置較低容易造成假陽(yáng)性，設(shè)置過(guò)高容易造成假陰性[5]。因此在弱陽(yáng)性樣本的判斷上，不同核酸檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品可能會(huì)得出不同結(jié)論。對(duì)于此也有研究表明不同試劑對(duì)弱陽(yáng)性樣本檢出能力是有很大差異[6,7]。因此有研究建議對(duì)于沒(méi)有灰區(qū)設(shè)置的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒，當(dāng)檢出的Ct值與判斷陽(yáng)性閾值的Ct值的差小于3時(shí)，建議進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以排除假陽(yáng)性或假陰性的可能[8]。交叉反應(yīng)主要是驗(yàn)證與檢測(cè)對(duì)象可能存在交叉反應(yīng)的核酸物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，對(duì)于冠狀病毒核酸檢測(cè)來(lái)說(shuō)，主要與檢測(cè)對(duì)象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，由于本室資源有限僅驗(yàn)證了甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、EB 病毒、人巨細(xì)胞病毒和結(jié)核分枝桿菌無(wú)交叉反應(yīng)。

雖然試劑盒上市前經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)，但是進(jìn)入新實(shí)驗(yàn)室臨床檢驗(yàn)前還需進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證其產(chǎn)品符合其聲明的范圍，保證檢驗(yàn)質(zhì)量的可靠性。本研究結(jié)果表明上海伯杰醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒在Lepgen-96全自動(dòng)醫(yī)用PCR儀上兩個(gè)濃度的參考品兩個(gè)靶基因的批內(nèi)批間精密度均小于5%，陰陽(yáng)性符合率達(dá)100%，驗(yàn)證了其聲明的最低檢出限為500copies/mL，交叉反應(yīng)等參數(shù)進(jìn)行基本符合臨床應(yīng)用要求。