黃芩苷抗腫瘤作用機制的研究進展

劉夢珂，紀濛濛，程 林，黃金艷，孫曉建，趙維蒞，王 黎

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血液科，上海市血液學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國家重點實驗室，國家轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海200025

傳統(tǒng)中藥治療腫瘤的研究已引起廣泛的關(guān)注。中藥療法作為放射療法和化學(xué)療法（化療）的輔助治療，在提高患者生存質(zhì)量和生存率方面取得了顯著的成效［1］。黃芩苷作為中藥黃芩的主要有效成分之一，具有良好的抗氧化、抗炎癥、抗病毒和抗腫瘤的作用。研究［2］表明，黃芩苷能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，防治腫瘤轉(zhuǎn)移。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、白血病和淋巴瘤等疾病中具有輔助治療的作用。本文就黃芩苷對腫瘤的影響及主要機制進行總結(jié)，以期為應(yīng)用黃芩苷治療腫瘤的思路提供參考。

1 黃芩苷對腫瘤細胞增殖與凋亡的影響

1.1 阻滯腫瘤細胞周期

研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有阻滯細胞周期和抑制腫瘤細胞增殖的作用。細胞周期是細胞增殖中遺傳物質(zhì)復(fù)制和細胞分裂的過程，主要由G0/G1、S、G2、M 期組成。細胞周期受調(diào)節(jié)基因和多種調(diào)控蛋白的影響，如周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）、周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclindependent-kinase inhibitor，CKI）［5］。經(jīng)黃芩苷處理后的結(jié)腸癌細胞HCT116、HT29 和SW480，G0/G1期細胞數(shù)量減少，多數(shù)細胞周期停滯于S期，且黃芪苷的劑量越高阻滯效果越明顯［3］。在肺癌細胞Hep G2 和SMMC-7721 中，黃芩苷同樣引起S 期停滯；且進一步實驗［4］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芩苷處理后G1期cyclin D1 表達下調(diào)，推動細胞分裂由S期向G2/M 期轉(zhuǎn)化的促分裂因子cyclin A 和CDK2 均隨黃芩苷劑量的增加而降低，也說明了黃芩苷有阻滯腫瘤細胞周期的作用。

1.2 促使腫瘤細胞衰老

誘導(dǎo)細胞衰老是抗腫瘤的手段之一。研究［6-8］表明，黃芩苷能夠促使腫瘤細胞衰老。細胞衰老是細胞增殖分化能力下降的生理過程，主要分為2種類型：①復(fù)制性衰老，與端?？s短相關(guān)。②外源性衰老，與一系列外源性因素，如氧化應(yīng)激、DNA 損傷、某些特定原癌基因的激活以及炎癥因子、趨化因子的作用相關(guān)［9］。Ren 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在白血病細胞HL-60 中，經(jīng)黃芩苷處理后的C-MYC 基因相關(guān)的mRNA 和蛋白表達水平，以及人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）的mRNA 表達水平均下降。C-MYC 能夠結(jié)合到目標(biāo)基因，如hTERT的啟動子區(qū)域，啟動hTERT 的轉(zhuǎn)錄，從而參與端粒酶的調(diào)節(jié)，與腫瘤細胞增殖衰老相關(guān)。黃芩苷能降低hTERT 基因在腫瘤細胞中的表達，抑制端粒酶活性，誘導(dǎo)HL-60 細胞衰老和凋亡［6］。另外，黃芩苷能夠降低腫瘤細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水 平， 提 高 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）水平，造成低氧環(huán)境，上調(diào)結(jié)腸癌細胞HCT116 中低氧應(yīng)答的孕酮誘導(dǎo)蛻膜蛋白（decidual protein induced by progesterone，DEPP）的水平。DEPP分子在低氧條件下能增強絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號的磷酸化，提高RAF1 和ERK 分子的表達水平，激活Ras/Raf/MEK/ERK 以及p16INK4a/Rb 信號通路，導(dǎo)致腫瘤細胞衰老［7］。原癌基因誘導(dǎo)的衰老是一種由高表達原癌基因促進細胞快速增殖，加速細胞周期提早發(fā)生衰老的機制，在正常細胞和早期癌癥中具有監(jiān)視和清除腫瘤細胞的作用。有報道［8］稱，Ras/Raf/MEK/ERK 信號通路的上游原癌基因Ras在低表達時促進腫瘤發(fā)生，而在過表達時激活抑癌通路，產(chǎn)生不可逆衰老，如p16INK4a基因。

1.3 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是調(diào)節(jié)正常組織穩(wěn)態(tài)，清除損傷、衰老和被感染細胞的細胞程序性死亡，分為細胞表面死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。外源性途徑可由細胞表面受體和配體結(jié)合而誘導(dǎo)，如腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）結(jié)合，F(xiàn)as（CD95/APO-1）與Fas 配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）結(jié)合等［10］。內(nèi)源性途徑的激活可由低氧、遺傳物質(zhì)損傷、細胞質(zhì)高Ca2+濃度、輻射和化學(xué)藥物等誘導(dǎo)線粒體損傷而產(chǎn)生［10］。內(nèi)源性凋亡的機制為B 細胞淋巴瘤2 蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）家族中促凋亡的Bcl-2 相關(guān)蛋白X（Bcl-2 associated X， Bax）、 Bcl-2 拮 抗 蛋 白（Bcl-2 antagonist killer，Bak）和家族中的抗凋亡蛋白（如Bcl-2）結(jié)合，導(dǎo)致線粒體膜破裂，膜內(nèi)凋亡因子（如細胞色素C）釋放到細胞質(zhì)，誘導(dǎo)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9前體（pro-cysteine-containing aspartate-specific protease 9，pro-caspase-9）自身活化和蛋白酶水解，激活下游caspase-3、caspase-6、caspase-7，導(dǎo)致細胞凋亡［10］。研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷主要影響腫瘤細胞內(nèi)源性凋亡，通過多種信號通路影響B(tài)cl-2家族蛋白、細胞色素C、caspase-3、caspase-9等蛋白表達，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

1.3.1 下調(diào)Bcl-2 蛋白啟動內(nèi)源性凋亡 卵巢癌模型中，黃芩苷使得Bcl-2 家族蛋白中的抗凋亡蛋白表達降低，同時caspase-3 剪 切 體 （cleaved-caspase-3） 和cleavedcaspase-9 表達升高，提示其通過激活caspase 相關(guān)信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡［11］。Wang 等［12］在消化道腫瘤中同樣發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能誘導(dǎo)Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA 表達升高和Bcl-2 表達降低，在細胞凋亡的線粒體通路中有重要作用。

1.3.2 抑制腫瘤細胞內(nèi)信號通路誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡 在白血病和淋巴瘤中，黃芩苷均能夠通過抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT 信號通路誘導(dǎo)凋亡［13］。在淋巴瘤細胞CA46 中，黃芩苷不僅能降低AKT 的表達，而且能夠抑制AKT 及其下游信號的磷酸化水平，降低核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平，提高NF-κB抑制劑（inhibitor of NF-κB，IκB）水平。細胞質(zhì)中抗凋亡作用的NF-κB 與其抑制劑IκB 形成復(fù)合體，表現(xiàn)為失活狀態(tài)；而活化的AKT 可誘導(dǎo)IκB 磷酸化并使游離的NF-κB 入核，啟動抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。黃芩苷抑制PI3K/AKT/NF-κB通路從而誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡，依次裂解pro-caspase-9、pro-caspase-3 和核糖聚合酶并降解DNA［14］。

非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC） 中，黃芩苷上調(diào)去乙?；? （sirtuin 1，SIRT1） 基因的表達和AMP 活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase， AMPK）的磷酸化水平，SIRT/AMPK 信號在NSCLC 細胞中表達為抑癌基因通路，AMPK 的激活能夠抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）的磷酸化，而磷酸化的mTOR 可抑制細胞凋亡相關(guān)的caspase 通路和自噬。因此，激活SIRT/AMPK 通路，增加了NSCLC 的細胞凋亡［15］。

1.3.3 增加腫瘤細胞內(nèi)Ca2+含量誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡 在惡性膠質(zhì)瘤細胞U87 和U251 中，黃芩苷能夠增加細胞內(nèi)Ca2+含量，Ca2+在細胞自噬和凋亡過程中均有作用。高濃度Ca2+可升高多腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADPribose）polymerase，PARP］、Bax 和cleaved-caspase 3 水平，促進細胞凋亡［16］。

1.3.4 作用于腫瘤原癌基因誘導(dǎo)內(nèi)源性凋亡 黃芩苷也能作用于RNA，通過致癌微RNA（oncogenic microRNA，oncomiRNA），誘導(dǎo)凋亡。Tao 等［17］在對結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠抑制oncomiRNA 誘導(dǎo)細胞凋亡。對黃芩苷處理后的細胞進行RNA 芯片檢測顯示，37 種oncomiRNA 的 表 達 降 低， 包 括miR-10a、 miR-23a、miR-30c、miR-31、miR-151a 和miR-205 等。通過基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）對這些miRNA和其靶基因功能分析發(fā)現(xiàn)，許多凋亡相關(guān)通路如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路、p53 信號通路等的表達顯著增強，且進一步研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過抑制原癌基因c-MYC的蛋白表達，下調(diào)oncomiRNA水平，誘導(dǎo)細胞凋亡。另外，有研究［18］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷通過miR-217/Dickkopf 1（DKK1）抑制Wnt/β-catenin信號通路和下游的c-MYC mRNA表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。

2 黃芩苷對腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的影響

2.1 抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移過程中具有重要的作用。上皮細胞與基底膜黏附降低并向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腫瘤遷移和入侵。這一過程是由多種信號通路（包括Wnts、Notch、TGF-β等）介導(dǎo)的［19］。

在乳腺癌細胞中，黃芩苷通過抑制TGF-β 通路介導(dǎo)的EMT 來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。TGF-β 結(jié)合相應(yīng)受體TβRⅠ、TβR Ⅱ和TβR Ⅲ，激活轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生鈣黏蛋白（cadherin）亞型的轉(zhuǎn)化。在EMT過程中，E-cadherin表達降低，N-cadherin 表達升高，TGF-β1 激活轉(zhuǎn)錄因子snail、slug、twist，以及E 盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding protein 1，ZEB1）、ZEB2［20］。黃芩苷能使乳腺癌細胞MDA-MB-231 和4T1 中的上皮細胞標(biāo)志物E-cadherin和密封蛋白（claudin）表達上調(diào)，間質(zhì)細胞標(biāo)志物Ncadherin 和波形蛋白（vimentin）以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子snail、slug 下調(diào)。進一步實驗［21］表明，黃芩苷還能通過抑制p38MAPK 和β-catenin 信號通路實現(xiàn)抑制EMT 和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

另外，有研究［22］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對TGF-β/Smad 信號通路有抑制作用。在Smad 信號通路中，TGF-β 刺激Smad2 和Smad3 磷酸化，形成Smad2/3 復(fù)合體進而誘發(fā)EMT。黃芩苷顯著抑制了Smad2和Smad3的磷酸化水平，從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT。

2.2 抑制細胞外基質(zhì)和基底膜降解

腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的環(huán)節(jié)包括細胞外基質(zhì)和基底膜降解等?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是降解細胞外基質(zhì)的唯一一類蛋白水解酶，與基質(zhì)重塑、介導(dǎo)腫瘤血管新生相關(guān)，其中MMP-2和MMP-9在腫瘤轉(zhuǎn)移中尤為重要［23］。Wang 等［24］通過實驗驗證了黃芩苷能夠通過p38MAPK 通路抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231 中MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。在宮頸癌細胞Hela 中，同樣發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過抑制p38MAPK 信號通路的活性降低MMP-2、MMP-9 的表達［25］。

3 黃芩苷對腫瘤免疫的影響

3.1 抑制腫瘤免疫逃逸

黃芩苷有抑制腫瘤表面免疫檢查點、刺激免疫反應(yīng)的作用。腫瘤細胞表面對免疫調(diào)節(jié)有抑制作用的細胞程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）結(jié)合細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表面的程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1），抑制CTL 的抗腫瘤效應(yīng)，造成腫瘤免疫逃逸［26］。研究［26］發(fā)現(xiàn)，在黃芩苷治療后的BALB/c肝癌小鼠模型中，腫瘤組織CD8+細胞數(shù)量增加，同時使PD-L1 表達下調(diào)。據(jù)文獻［27］報道，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在PD-L1的表達中起作用。而黃芩苷處理的細胞STAT3磷酸化水平下降，提示其可能通過抑制STAT3，下調(diào)PD-L1表達。

3.2 激活正向免疫調(diào)節(jié)

黃芩苷對免疫微環(huán)境的影響也體現(xiàn)在調(diào)節(jié)細胞因子水平，如降低TNF-α、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-10 等水平和升高IL-2 水平。在乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 和 接 種MDA-MB-231 細 胞 的BALB/c 小鼠血清中，黃芩苷能夠降低TNF-α 和IL-1β 的濃度。TNF-α 和IL-1β 通過結(jié)合細胞膜特異性受體，調(diào)節(jié)NF-κB 通路，發(fā)揮促炎癥反應(yīng)的作用［28］。在肺癌細胞A549和H1299中，黃芩苷也能降低尼古丁誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6 水平［29］，通過抑制癌癥中的相關(guān)炎癥反應(yīng)，減緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在兒童急性淋巴細胞白血病的研究［30］中，黃芩苷有增加外周血白細胞中γ 干擾素（interferonγ，IFN-γ）分泌，降低骨髓細胞中TNF-α 和IL-10分泌的作用。另外，BALB/c 肝癌小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)黃芩苷使得IL-2水平升高，對T細胞的活動有正向調(diào)節(jié)作用［26］。

此外，黃芩苷對免疫微環(huán)境的影響在其他炎癥模型及自身免疫性疾病中也得到證實。黃芩苷有通過表觀遺傳影響炎癥反應(yīng)的作用。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC） 被證明具有抑制炎癥因子（如IL-1β，TNF-α）的作用，而組蛋白甲基化修飾可招募NF-κB 促進促炎基因的表達，與慢性炎性疼痛的發(fā)生有關(guān)。在誘發(fā)神經(jīng)性疼痛的小鼠模型中，黃芩苷通過調(diào)控組蛋白的乙?；揎棞p少炎癥因子的表達，從而抑制神經(jīng)痛的發(fā)生。并且黃芩苷能抑制HDAC1 磷酸化，直接通過翻譯后修飾影響HDAC1 蛋白的結(jié)構(gòu)，降低HDAC1 的表達，抑制炎癥反應(yīng)［31］。在自身免疫性疾病中，黃芩苷調(diào)控調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg cell）和效應(yīng)性T 細胞（effector T cell，Teff cell）的平衡，增加Treg細胞的數(shù)目，減少Teff 細胞數(shù)目，抑制CD4+T 細胞的增殖，減少細胞因子的釋放，從而抑制免疫反應(yīng)［32］。這些免疫調(diào)節(jié)的過程在黃芩苷抗腫瘤作用中具有重要的意義，也為進一步探索黃芩苷對腫瘤微環(huán)境的影響提供了新的思路。

3.3 激活宿主固有免疫

黃芩苷對固有免疫有激活作用。在兒童急性淋巴細胞白血病中，當(dāng)患者感染了水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），由于體內(nèi)IFN 產(chǎn)生缺陷導(dǎo)致VSV復(fù)制水平升高。黃芩苷能激活固有免疫，升高IFN-α/β，促進自然殺傷細胞（natural killer cell， NK cell）的非特異性抗病毒作用，降低VSV的效價［30］。

3.4 誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細胞復(fù)極化

黃芩苷能誘導(dǎo)肝癌細胞中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumorassociated macrophage，TAM）的復(fù)極化。TAM 是腫瘤微環(huán)境中影響腫瘤細胞增殖、侵襲及相關(guān)免疫反應(yīng)的一類重要細胞，分為2 種類型——M1 型和M2 型，其中M2 型占主導(dǎo)成分。M1 型巨噬細胞能促進吞噬、清除腫瘤細胞、抑制腫瘤的發(fā)展；M2 型巨噬細胞有免疫抑制和促進腫瘤血管新生的作用［33］。黃芩苷通過誘導(dǎo)TAM 自噬，使M2 型巨噬細胞向有著抗腫瘤作用的M1 型巨噬細胞復(fù)極化。文獻［34］報道，自噬相關(guān)的RelB/p52 通路有調(diào)控Th1、Th2 表型的作用。在黃芩苷的處理下，轉(zhuǎn)錄因子RelB 被抑制，M2 型巨噬細胞下調(diào)，促進腫瘤細胞的清除。

4 黃芩苷與其他抗腫瘤藥物的協(xié)同作用

黃芩苷除了有直接的抗腫瘤作用外，還可通過與其他抗腫瘤藥物協(xié)同作用，增強抗腫瘤藥物的效果，從而抑制腫瘤的發(fā)展。黃芩苷具有下調(diào)HL-60/ADM 細胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白1 （multidrug resistance-associated protein 1，MRP1） 和肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-associated protein，LRP）表達的作用，與阿霉素協(xié)同，逆轉(zhuǎn)細胞耐藥，從而增強阿霉素療效，促進細胞凋亡［35］。另外，有研究［36］發(fā)現(xiàn)，在間皮瘤細胞MESO924 中，黃芩苷能夠通過阻滯PI3K/AKT/mTOR信號通路，與化療藥物協(xié)同作用，增強化療藥物如阿霉素、順鉑、培美曲塞的藥效。

5 結(jié)語與展望

隨著研究者們對中醫(yī)藥抗腫瘤機制的關(guān)注，黃芩苷這一有效成分的藥效和機制的研究越來越多。學(xué)者們證明了其在阻滯腫瘤細胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、促進免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬等方面的作用。但黃芩苷抗腫瘤的作用機制及對腫瘤微環(huán)境的影響仍值得進一步探索，以期為其臨床應(yīng)用提供新的思路，對惡性腫瘤的輔助治療有所幫助。