microRNA在骨組織修復(fù)中的研究進(jìn)展

任航，閆景龍

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨六科，黑龍江 哈爾濱 150081)

目前，由創(chuàng)傷、炎癥或腫瘤切除導(dǎo)致的大節(jié)段性骨缺損及復(fù)雜類型骨折的治療仍是骨科領(lǐng)域面臨的難題[1]。骨組織的延遲愈合或不愈合不僅給患者帶來長(zhǎng)期疼痛，影響其生活質(zhì)量，還會(huì)因反復(fù)的手術(shù)治療增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至導(dǎo)致患者死亡率升高，因此尋求一種提高骨組織修復(fù)質(zhì)量和速度的治療策略尤為重要。除傳統(tǒng)手術(shù)治療外，近年來人們還研究了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生長(zhǎng)因子等[2]生物療法，以及磁場(chǎng)和低強(qiáng)度脈沖超聲等[3]物理療法，盡管這些療法在一定程度上促進(jìn)了骨組織修復(fù)，但均無法取得滿意的治療效果。已有研究表明[4]，微小RNA(micro-RNA，miRNA)作為一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小型非編碼RNA，對(duì)于骨、軟骨和肌肉組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，在骨組織修復(fù)過程中表達(dá)水平顯著改變，有望成為復(fù)雜類型骨折、骨缺損等疾病治療的新靶點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要描述了miRNA的生物合成、成骨調(diào)控功能以及在骨折、骨缺損的研究現(xiàn)狀，并且探討了miRNA作為骨組織修復(fù)潛在的靶點(diǎn)。

1 miRNA在生物體內(nèi)的合成

miRNA是一種非編碼的單鏈RNA，在基因表達(dá)中起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。miRNA基因在基因組的基因間隔區(qū)呈聚集存在，因此它們能夠轉(zhuǎn)錄成多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[5]。miRNA的轉(zhuǎn)錄過程在細(xì)胞核內(nèi)開始[6]：(1)最初由RNA聚合酶Ⅱ生成含有初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；(2)然后經(jīng)由核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)Drosha酶與dsRNA-結(jié)合區(qū)域蛋白DGCR8形成的多蛋白復(fù)合體加工，形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(miRNA precursor，pre-miRNA)；(3)由內(nèi)含子編碼形成的pri-miRNA經(jīng)剪接體處理后，同樣生成pre-miRNA；(4)這兩種pre-miRNA通過Ran-GTP依賴機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；(5)經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Dicer酶和反式激活效應(yīng)元件RNA結(jié)合蛋白(TAR RNA binding protein，TRBP)加工形成長(zhǎng)度19～25個(gè)核苷酸的雙鏈成熟miRNA，隨后雙鏈展開形成單鏈miRNA；(6)單鏈miRNA被加載到Argonaut蛋白上，與Dicer酶共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體；(7)miRNA與目標(biāo)miRNA上的3'-非翻譯區(qū)域(3’untranslated regions，3’UTR)完全結(jié)合則誘導(dǎo)目標(biāo)miRNA的降解，不完全結(jié)合則抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)合成達(dá)到目標(biāo)基因的沉默。

2 miRNA在成骨中的調(diào)控作用

成骨的過程主要涉及BMP及Wnt/β聯(lián)合蛋白信號(hào)通路。BMP與細(xì)胞表面I型和Ⅱ型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體結(jié)合，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Smad磷酸化，形成Smad復(fù)合體，激活成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Dlx5，引起Osx和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨特異轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，誘導(dǎo)成骨分化[7]。與BMP信號(hào)通路相似，Wnt/β聯(lián)合蛋白信號(hào)通路通過上調(diào)Runx2誘導(dǎo)成骨分化，此外BMP2還能刺激Wnt配體轉(zhuǎn)錄，抑制β-TrCP，協(xié)同Wnt/β聯(lián)合蛋白信號(hào)通路促進(jìn)成骨[8]。Zhang等[9]證明miR-93-5p與BMP-2的RNA3’ UTR不完全配對(duì)結(jié)合，通過抑制BMP-2的表達(dá)從而調(diào)控成骨分化。Fang等[10]研究證明miR-106b-5p及miR-17-5p能夠靶向抑制Smad5，從而抑制BMP-2的產(chǎn)生及成骨分化，而使用這兩種miRNA的拮抗劑，能提高Smad5的mRNA以及ALP、Runx2等成骨活性標(biāo)記物的水平。Laxman等[11]研究結(jié)果表明，miR-203和miR-320b通過抑制Dlx5及其下游信號(hào)通路來抑制BMP誘導(dǎo)的成骨分化。Fan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-450b能結(jié)合成骨抑制因子BMP-3的3’UTR區(qū)，抑制其表達(dá)，促進(jìn)成骨分化。Luo等[13]發(fā)現(xiàn)let-7i-3p通過負(fù)調(diào)節(jié)淋巴增強(qiáng)因子1(lymphoid enhancer factor 1，LEF1)，抑制Wnt/β聯(lián)合蛋白通路的表達(dá)從而抑制成骨分化。Tang等[14]發(fā)現(xiàn)miR-433-3p能夠與Wnt信號(hào)通路的拮抗劑分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK1)miRNA的3’UTR結(jié)合，抑制其翻譯，增強(qiáng)Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)成骨分化。綜上所述，在成骨過程中micro-RNA通過調(diào)節(jié)BMP或Wnt/B連環(huán)蛋白信號(hào)通路中的相關(guān)因子，最終影響Runx2的表達(dá)，這是micro-RNA在成骨分化發(fā)揮作用的條件之一。

3 miRNA與骨折修復(fù)

3.1 miRNA在骨折后的表達(dá) 骨折的修復(fù)是一個(gè)連續(xù)的動(dòng)態(tài)過程，包括血腫機(jī)化、原始骨痂形成和骨痂改造塑形三個(gè)階段，micro-RNA的表達(dá)水平在這一過程發(fā)生顯著變化[15]。Yavropoulou等[16]采用病例對(duì)照方法研究了循環(huán)miRNA與絕經(jīng)后婦女低骨密度椎體骨折的聯(lián)系，總共納入了100名絕經(jīng)后婦女進(jìn)行研究，包括35例低骨密度且椎體骨折的患者、35例低骨密度不伴有骨折的患者以及作為對(duì)照組的30例健康人。通過檢測(cè)血清樣本中分離出的14種miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比低骨密度患者血清miR-124、miR-2861顯著升高，miR-21、miR-23和miR-29顯著降低，進(jìn)一步分析顯示miR-21-5p在骨折患者血清樣本中表達(dá)顯著降低。研究人員不僅在患者血清樣本中發(fā)現(xiàn)了異常表達(dá)的miRNA，還在患者的骨組織中發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。在另一臨床研究中，De-Ugarte等[17]比較了因骨質(zhì)疏松骨折(n=6)及骨關(guān)節(jié)炎(n=6)進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換獲得的新鮮股骨頸骨小梁組織中的miRNA的表達(dá)。該研究采用miRNA陣列分析和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-320a和miR-483-5p在骨質(zhì)疏松骨折中顯著表達(dá)。值得注意的是這兩項(xiàng)研究存在一定的局限性，二者均采用的是骨質(zhì)疏松骨折患者的樣本，并非是健康人群骨折的樣本，因此需要考慮骨質(zhì)疏松對(duì)miRNA的影響。除了上述臨床研究外，一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者還進(jìn)行了動(dòng)物骨折模型的miRNA分析研究。Hadjiargyrou等[18]首次報(bào)道了小鼠骨折修復(fù)早期的miRNA轉(zhuǎn)錄組，研究人員利用小鼠股骨單側(cè)骨折模型，通過將骨折早期的愈傷組織及健側(cè)骨組織分離出的miRNA與小鼠miRNA基因芯片雜交，發(fā)現(xiàn)與健側(cè)骨組織相比，愈合組織中存在306個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA，374個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA，另有20個(gè)miRNA同時(shí)表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。miRNA在骨折后表達(dá)水平發(fā)生顯著改變，通過血清提取miRNA具有簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)點(diǎn)，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，miRNA能夠成為骨折早期診斷及病情監(jiān)測(cè)的新靶點(diǎn)。

3.2 miRNA在骨折的治療研究 存在于骨髓及結(jié)締組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)，具備分化骨、軟骨、肌肉等多種細(xì)胞系的潛能。最近一些研究表明，miRNA的表達(dá)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)分化成特定譜系有關(guān)。Shi等[19]將轉(zhuǎn)染了miR-218 BMSC局部注射至小鼠股骨骨折部位，通過micro-CT及組織學(xué)免疫組化等方式發(fā)現(xiàn)miR-218能夠改善新骨形成，加速骨折愈合。Lee等[20]將載有miR-29b-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC注射至小鼠股骨骨折部位，觀察其對(duì)骨折愈合的影響，發(fā)現(xiàn)單次注射治療可以顯著提高骨密度增加骨體積分?jǐn)?shù)，而重復(fù)的注射無法增加治療效果。然而促進(jìn)骨折愈合是否是miRNA的普遍功能仍然存在爭(zhēng)議。

miRNA還可以作為祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子。Yao等[21]發(fā)現(xiàn)小鼠成骨細(xì)胞中miR-185的表達(dá)增加與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、Wnt5b、β-連環(huán)蛋白表達(dá)減少有關(guān)，提示miR-185可能通過靶向PTH阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白通路抑制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，對(duì)成骨產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)作用。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-155的過表達(dá)可以抑制裸鼠皮下間充質(zhì)干細(xì)胞的異位成骨，基因檢測(cè)顯示在這一過程中miR-155能夠通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體9，從而降低成骨相關(guān)基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明miRNA作為內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，對(duì)骨組織再生至關(guān)重要。基于miRNA的基因療法對(duì)于復(fù)雜性骨折的治療有很大潛力，仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究來探索miRNA在骨折修復(fù)過程中各時(shí)間段的確切作用。

4 miRNA與骨缺損修復(fù)

4.1 miRNA與成骨-成血管耦聯(lián) 一項(xiàng)系統(tǒng)綜述[23]結(jié)果表明，miRNA通過調(diào)控新血管的生成促進(jìn)骨缺損修復(fù)。骨缺損的發(fā)生常伴隨著血管損傷，造成局部的缺血、缺氧，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及干細(xì)胞的運(yùn)輸，導(dǎo)致支架材料在植入的最初階段發(fā)生細(xì)胞死亡，引起最終的骨缺損修復(fù)的失敗或延遲愈合。Ramasamy等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨組織中存在一種對(duì)CD31強(qiáng)陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，具有介導(dǎo)血管周圍骨祖細(xì)胞分化的功能。Yang等[25]采用miRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)在CD31 hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞中miR-497～195簇表達(dá)水平顯著升高。研究人員通過尾靜脈將構(gòu)建的aptamer-agomiR-195注射至WT小鼠體內(nèi)，在3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)CD31 hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞及成骨細(xì)胞數(shù)量成倍增加，且骨小梁的數(shù)目、體積及厚度均增高。Zhang等[26]的研究表明，提高miR-378表達(dá)能夠增強(qiáng)BMSC成骨分化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-378的BMSC顯著增加了Runx2、BMP-2、骨鈣素(osteocalcin，OCN)等成骨基因及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和Ang-1等血管生成基因的表達(dá)水平。體外培養(yǎng)14d后采用基底膜基質(zhì)血管造影法，發(fā)現(xiàn)新生血管的分支數(shù)量和長(zhǎng)度顯著高于陰性對(duì)照組。Zhang等[26]的研究結(jié)果提示miR-378可作為成骨-成血管耦合的理想靶點(diǎn)。此前，Eskildsen等[27]的研究已經(jīng)證明antimir-138通過增強(qiáng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2磷酸化水平以及Runx2的表達(dá)促進(jìn)MSC成骨分化。Yan等[28]通過體外研究發(fā)現(xiàn)antimir-138能夠促進(jìn)MSC的VEGF的表達(dá)。研究人員利用antimir-138轉(zhuǎn)染MSC薄片，將其包裹在鈦棒表面并植入小鼠皮下。體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8周后在含有antimir-138植入體的周圍形成大量新生骨并且含有豐富的新生血管。以上研究結(jié)果表明，miRNA積極參與成骨-成血管耦聯(lián)的調(diào)控，具有促進(jìn)骨組織修復(fù)的治療潛力，但仍需要進(jìn)一步研究其確切機(jī)制。

4.2 miRNA與骨科支架材料 miRNA在大塊骨缺損的治療中具有促進(jìn)組織修復(fù)作用。目前臨床上針對(duì)骨缺損的治療包括自體骨移植、異體骨移植和人工骨移植，其中自體骨移植被認(rèn)為是骨缺損修復(fù)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但是其臨床應(yīng)用常常受到供體部位的限制，因此近年來生物支架材料作為自體骨修復(fù)重建的一種替代方法受到人們的關(guān)注[29]。研究[30]發(fā)現(xiàn)將BMP等促進(jìn)成骨的細(xì)胞因子聯(lián)合支架材料能夠誘導(dǎo)新骨形成，但是這些外源性細(xì)胞因子在體內(nèi)半衰期短，易被快速降解，無法起到持續(xù)調(diào)控作用。而miRNA能夠內(nèi)源性的促進(jìn)骨組織自身分泌信號(hào)，產(chǎn)生成骨相關(guān)細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)大塊骨缺損部位的愈合。Yang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，用表達(dá)miR-21的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合β-TCP材料對(duì)顱骨缺損大鼠進(jìn)行治療后，缺損部位新骨形成及礦化的體積和P-AKt及HIF-1α表達(dá)水平顯著高于不含miR-21支架的對(duì)照組，而PTEN的表達(dá)水平降低，提示這一過程可能與miR-21基因靶向激活PTEN/PI3K/AKT/HIF-1α信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)。Yuan等[32]將轉(zhuǎn)染了antimiR-26a-5p的脂肪干細(xì)胞聯(lián)合雙相磷酸鈣支架用于大鼠股骨缺損的治療，可在第8周修復(fù)骨缺損并提高了骨密度及骨小梁的數(shù)量。Zhang等[33]合成了一種包裹miR-26a的聚乳酸微球，并將這些微球鏈接到脫細(xì)胞納米纖維聚合物支架上，在空間和時(shí)間上控制miR-26a的釋放，從而持續(xù)激活內(nèi)源性干細(xì)胞修復(fù)骨缺損?？傊甿iRNA聯(lián)合支架材料的應(yīng)用可以更快的錨準(zhǔn)特定組織，實(shí)現(xiàn)對(duì)局部組織傳遞治療，未來還需要深入研究支架材料的構(gòu)建，從而精準(zhǔn)的控制miRNA釋放，為骨缺損的治療提供新的策略。

5 總結(jié)與展望

隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于miRNA的研究越來越受到關(guān)注。目前已經(jīng)證明miRNA在骨折發(fā)生后表達(dá)水平顯著改變，其潛在機(jī)制可能是通過調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達(dá)影響骨折愈合[34]。此外一些特殊的miRNA還能夠促進(jìn)VEGF等血管生成基因表達(dá)，在成骨-成血管耦聯(lián)中發(fā)揮積極作用。但是miRNA能夠參與多靶點(diǎn)的調(diào)控，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可能發(fā)生脫靶效應(yīng)導(dǎo)致骨以外的組織發(fā)生不良反應(yīng)，未來仍要深入研究如何特異性的傳遞miRNA達(dá)到特定的細(xì)胞和分子靶點(diǎn)，這有助于研發(fā)更好的骨組織修復(fù)的治療策略。作者認(rèn)為當(dāng)前miRNA在骨組織修復(fù)的治療仍處于發(fā)展階段，動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)結(jié)果不足以立即應(yīng)用于臨床，基于miRNA的診斷和治療有望在未來發(fā)揮作用，但亟需更廣泛的實(shí)驗(yàn)研究。