外泌體在口腔組織修復(fù)與再生中的研究進(jìn)展

張 璐，王凱欣，王曉春

外泌體是直徑為40～100 nm，密度為1.10～1.18 g/mL的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的小囊泡[1]，起初它被認(rèn)為是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物[2]，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在細(xì)胞通信方面發(fā)揮作用，是細(xì)胞旁分泌的介質(zhì)，具有重要的細(xì)胞間調(diào)節(jié)功能。在最近的臨床干細(xì)胞實驗研究中，有結(jié)論表明，不僅干細(xì)胞利用率低下，且有一部分干細(xì)胞注射會引起嚴(yán)重并發(fā)癥，例如腫瘤[3]。這讓我們不得不考慮干細(xì)胞療法的生物安全性。然而，隨著無細(xì)胞療法的出現(xiàn)，應(yīng)用外泌體作為組織再生的工具出現(xiàn)了，其優(yōu)點在于：它克服了傳統(tǒng)干細(xì)胞療法的局限性和風(fēng)險性，并可設(shè)定明顯的靶向性，為組織修復(fù)與再生開辟了新視角。口腔頜面部損傷可導(dǎo)致復(fù)雜的軟、硬組織缺損，包括皮膚、血管、神經(jīng)、骨、牙齒等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，外泌體作為無細(xì)胞療法促進(jìn)組織再生的潛在解決方案，在一定程度上可以實現(xiàn)口腔頜面部組織的修復(fù)和再生。此外，外泌體不僅可以應(yīng)用于修復(fù)、再生組織，它在抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、作為癌癥的診斷標(biāo)志物以及藥物載體等方面也有廣泛應(yīng)用[4]。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的來源及生物學(xué)性狀

細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，根據(jù)生物發(fā)生、大小、密度和主要蛋白標(biāo)記物可分為：微囊泡、凋亡小體、外泌體等[5]。外泌體作為胞外囊泡的一種，能被內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)等各種細(xì)胞分泌與攝取，且不同來源的外泌體在形態(tài)、內(nèi)容物和功能方面都具有特異性[6]。外泌體的形成與釋放過程不同于其他微囊泡的出芽方式，其形成過程為：細(xì)胞膜首先向內(nèi)出芽形成多囊泡內(nèi)體(multivesicular body，MVB)，MVB內(nèi)陷形成雙層脂質(zhì)層結(jié)構(gòu)的內(nèi)囊泡，即為外泌體，當(dāng)MVB與細(xì)胞膜融合時，外泌體以胞吐的形式被釋放到細(xì)胞外[7]。外泌體在細(xì)胞外環(huán)境中可以通過三種途徑與受體細(xì)胞相互作用：通過內(nèi)吞攝取或通過囊泡與細(xì)胞膜的直接融合進(jìn)入細(xì)胞，也可能通過配體受體介導(dǎo)，以粘附到細(xì)胞表面來傳遞其內(nèi)含物。外泌體內(nèi)含有母細(xì)胞的特定物質(zhì)：RNA、游離脂肪酸、蛋白質(zhì)、表面受體以及細(xì)胞因子等[5]，使其可以作為介入靶點，在組織修復(fù)再生[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]、癌癥發(fā)展[10]、臨床疾病診斷[11]等過程中發(fā)揮重要作用。外泌體所含有的的蛋白包括四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82)、熱休克蛋白、脂蛋白等，還有一些轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，能將外泌體定位于特定的靶細(xì)胞，參與機(jī)體多種生物學(xué)過程[12]。

目前，基于外泌體的大小、密度、免疫親和力等，廣泛應(yīng)用的外泌體提取技術(shù)有：超速離心、密度梯度離心、大小排阻色譜、微流體分離法、免疫吸附法等[13-14]。超速離心法是當(dāng)前被廣泛應(yīng)用的提取金標(biāo)準(zhǔn)，但它也有缺點，例如耗時長、需要大量樣品、獲得率低且存在其他顆粒污染[15]。與常規(guī)提取方法相比，基于微流體系統(tǒng)的外泌體分離技術(shù)可以快速、便攜且精確地處理納米顆?；蛏倭恳后w樣品[16]。

1.2 外泌體的功能

外泌體作為一種局部和全身的細(xì)胞間通信介質(zhì)，可以通過直接轉(zhuǎn)導(dǎo)或間接水平轉(zhuǎn)移大量RNA，蛋白質(zhì)和miRNA等，這些分子被遞送至鄰近和遠(yuǎn)處的細(xì)胞[17]，可以改變受體細(xì)胞的功能，從而調(diào)節(jié)周圍的微環(huán)境，在免疫系統(tǒng)和腫瘤發(fā)生中起重要作用。外泌體包含用于在免疫細(xì)胞之間或在免疫細(xì)胞與靶細(xì)胞之間傳遞信息的幾種分子，可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，發(fā)揮免疫抑制或免疫激活作用[18]。其中，抑制性外泌體可能影響促炎和抗炎效應(yīng)T細(xì)胞之間的平衡，有用于治療移植排斥或自身免疫疾病的潛能[19]。除了免疫細(xì)胞外，腫瘤細(xì)胞也可以分泌具有免疫活性的外泌體，對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一系列的有害影響，誘導(dǎo)活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞凋亡、單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞分化受損等[20]。腫瘤外泌體還可以與正常間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行通信，建立良好的腫瘤微環(huán)境，從而影響原發(fā)性腫瘤的生長及侵襲、轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成、血管生成以及免疫抑制，還能加強(qiáng)對化學(xué)療法的抵抗力[21]。外泌體雖能促進(jìn)本體的癌癥進(jìn)展，但它的特異性和可控性也使其成為檢測、控制和治療癌癥的新靶點[22]。外泌體中的特定組分對早期檢測各種癌癥有重要價值，例如，外泌體miRNA對肺腺癌的篩查[23]、卵巢癌的診斷[24]等有重要幫助，還可以作為區(qū)分低度惡性和高度惡性膀胱癌[25]、乳腺癌[26]的新型候選生物標(biāo)志物，也可以作為檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)記物[27]。另外，外泌體作為天然納米囊泡的優(yōu)勢，可根據(jù)相關(guān)疾病進(jìn)行修飾，作為生物活性載體產(chǎn)生細(xì)胞毒作用用于癌癥治療[28]，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用用于神經(jīng)退行性疾病的治療[29]，提高疾病治療的效果。外泌體的使用相對于細(xì)胞介導(dǎo)的藥物輸送系統(tǒng)，具有低免疫原性、低毒性、強(qiáng)循環(huán)滯留性，避免了人工合成載體的快速清除和細(xì)胞毒性的弊端，為將各種治療藥物傳輸至靶細(xì)胞提供了新型方法。

另外，外泌體作為一種新的遞送系統(tǒng)，還廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中的無細(xì)胞療法。在用于組織再生的傳統(tǒng)細(xì)胞療法中，干細(xì)胞的組織修復(fù)與再生功能的實現(xiàn)，不僅是在損傷部位的自身增殖和分化，可能主要是由旁分泌釋放的外泌體實現(xiàn)的[30]，外泌體充當(dāng)局部遞送系統(tǒng)，繼而影響鄰近和遠(yuǎn)端細(xì)胞實現(xiàn)組織修復(fù)與再生。目前研究表明外泌體能夠在骨、皮膚、血管、周圍神經(jīng)和牙齒相關(guān)組織等的再生中發(fā)揮作用。例如：MSC衍生的外泌體能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖以及血管生成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活膠原蛋白和彈性蛋白分泌，來誘導(dǎo)皮膚傷口的上皮再形成[31]；MSC外泌體還可以促進(jìn)肌肉再生[32]；并在神經(jīng)元損傷[33]和腦外傷模型[34]中修復(fù)和再生神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)出強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)能力。

2 外泌體在口腔頜面部組織修復(fù)與再生中的應(yīng)用

2.1 組織創(chuàng)傷的修復(fù)

口腔頜面部的軟硬組織損傷對于患者面部的形態(tài)及功能影響極大，快速且盡可能小瘢痕的軟組織修復(fù)和功能性骨組織的再生將是未來臨床治療的最終目標(biāo)。Cooper等[35]發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)分泌的包含LncRNA(MALAT1)的外泌體能夠促進(jìn)創(chuàng)口處人皮膚成纖維細(xì)胞的遷移和血管生成，而無需干細(xì)胞的參與，表明了使用含MALAT1的hADSCs產(chǎn)生的外泌體治療頜面部缺血性傷口的可能性。另外，外泌體可以加速創(chuàng)口愈合，使瘢痕組織形成最小化。Zhao等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)的外泌體可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，高濃度的外泌體(100 μg/mL)可能通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)的表達(dá)部分消除細(xì)胞外基質(zhì)的沉積以減少瘢痕形成，這說明，hAECs的外泌體可以作為無細(xì)胞療法用于頜面部無瘢痕傷口愈合的新希望。Wei等[37]用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)刺激巨噬細(xì)胞，其衍生的外泌體在體外有利于成骨細(xì)胞的分化，將該外泌體用于修飾鈦納米管植入物可以避免異位骨的形成并減少不良影響，這證明了外泌體整合的鈦納米管可作為新興的頜面部骨組織再生的功能材料。另外，源自人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal-ligament stem cells，hPDLSCs)[38]和人類牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(human gingival mesenchymal stem cells，hGMSCs)[39]的外泌體在顱骨缺損模型中，具有良好的生物相容性和成骨性能，能夠有效促進(jìn)骨愈合，成為顱骨損傷后重建的新策略。

2.2 周圍神經(jīng)組織再生

腫瘤或創(chuàng)傷可能導(dǎo)致口腔頜面部周圍神經(jīng)的損傷，導(dǎo)致部分或完全感覺和運(yùn)動神經(jīng)功能障礙，使患者生活質(zhì)量下降。然而，使用自體神經(jīng)移植需要犧牲功能正常的神經(jīng)，且移植干細(xì)胞可能會引起嚴(yán)重并發(fā)癥。近年來，隨著外泌體的研究進(jìn)展，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體對周圍神經(jīng)損傷后軸突再生具有促進(jìn)作用[40]。已有研究證實了來自MSC、施萬細(xì)胞(Schwann cells，SCs)等的外泌體在周圍神經(jīng)組織修復(fù)與再生中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。魏俊吉等[41]通過谷氨酸誘導(dǎo)體外神經(jīng)損傷，研究外泌體的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的信號途徑，發(fā)現(xiàn)外泌體可能通過激活PI3K-Akt信號途徑介導(dǎo)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞存活，發(fā)揮保護(hù)作用。另有研究表明，當(dāng)神經(jīng)損傷后，SCs脫分化為祖細(xì)胞樣狀態(tài)，其外泌體可以參與SCs與軸突間的相互作用，顯著促進(jìn)軸突再生，有效地引導(dǎo)軸突到達(dá)其原靶組織[42]。Wang等[43]的研究表明，SCs來源的外泌體可能參與了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向SCs的分化。以上研究為外泌體促進(jìn)周圍神經(jīng)再生提供了理論依據(jù)，外泌體可能是實現(xiàn)頜面部神經(jīng)損傷后修復(fù)和再生的新靶點。

2.3 血管再生

外傷或腫瘤術(shù)后的血運(yùn)重建對于頜面部軟硬組織再生至關(guān)重要，豐富的血運(yùn)形成給組織提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時，可以加速骨質(zhì)改建、神經(jīng)再生甚至牙髓再生，并維持新組織的活力。Zhang等[44]證明了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs)外泌體可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成，在大鼠皮膚燒傷模型的體內(nèi)實驗中，外泌體促進(jìn)了傷口愈合和血管生成，由此推測這可能是皮膚傷口愈合的重要機(jī)制。Hu等[45]將外泌體皮下注射于小鼠全層皮膚創(chuàng)面發(fā)現(xiàn)：外泌體的局部移植促進(jìn)了皮膚再上皮化，減少了瘢痕寬度，促進(jìn)了血管生成；在體外外泌體可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性。最終得到結(jié)論：外泌體是重要的血漿活性調(diào)控因子，可作為一種新的軟組織創(chuàng)面愈合策略，為將來外泌體應(yīng)用于口腔頜面部創(chuàng)傷后的血運(yùn)重建提供了新思路。更多的研究將口腔組織的干細(xì)胞在缺氧等應(yīng)激誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，或用促血管生成基因轉(zhuǎn)染，從而導(dǎo)致促血管生成外泌體的分泌，這使外泌體成為口腔組織再生中刺激性血管生成的新選擇[46]。

2.4 牙周組織再生

牙周炎所造成的牙周附著組織喪失和牙槽骨吸收即使去除炎癥也難以恢復(fù)，改善牙周附著水平和爭取組織的再生成為臨床牙周治療的更高追求。Chew等[47]在免疫活性大鼠模型中手術(shù)造成牙周組織缺損，然后使用含有人MSC外泌體的膠原海綿進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)這種膠原海綿可以促進(jìn)牙槽骨和牙周韌帶的再生，更有效地修復(fù)缺損。這個發(fā)現(xiàn)首次證明，MSC外泌體可能通過增加牙周韌帶細(xì)胞遷移和增殖來促進(jìn)牙周再生，是一種可行的即用型無細(xì)胞療法，用于治療牙周缺損，且沒有任何不良影響。Mohammed等[48]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體能夠作為非手術(shù)牙周治療的輔助工具，促進(jìn)牙周纖維、血管及牙槽骨等牙周組織的再生。這些發(fā)現(xiàn)表明，MSC外泌體可以作為牙周組織再生的無細(xì)胞策略，為外泌體應(yīng)用于臨床提供了基礎(chǔ)。

2.5 牙齒組織再生

牙齒是一個復(fù)雜的器官，由牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)和牙髓組織等組成，牙髓組織是牙齒中唯一的軟組織，由牙本質(zhì)包繞位于髓腔之內(nèi)，有為牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體提供營養(yǎng)物質(zhì)、傳導(dǎo)痛覺、形成牙本質(zhì)等重要作用。外傷、齲壞等都可導(dǎo)致牙體硬組織缺損，甚至使牙髓組織發(fā)炎從而壞死，恢復(fù)牙髓組織形態(tài)，可以恢復(fù)牙齒的功能性，以滿足美學(xué)和生理的需求[49]。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)顯然是用于牙髓再生最適合的干細(xì)胞來源，DPSCs的外泌體也為牙髓再生提供了更多的可能性。Hu等[50]鑒定了DPSCs外泌體的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在牙源性分化條件下分離的外泌體miRNA下調(diào)LTBP1，通過TGFβ1/smads信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)牙源性分化。Huang等[51]評估了牙髓干細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)牙源性分化的潛力，結(jié)果表明，外泌體可以與基質(zhì)蛋白結(jié)合，附著于生物材料，通過內(nèi)吞機(jī)制以劑量依賴性和飽和方式被DPSCs和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(human bone marrow derived stromal cells，HMSCs)內(nèi)吞，并觸發(fā)P38-MAPK途徑，促進(jìn)牙源性分化；其體外實驗結(jié)果也證明了外泌體可以觸發(fā)牙髓樣組織再生。血管生成對牙髓再生至關(guān)重要，Xian等[52]對DPSCs外泌體促血管生成的特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)外泌體促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、促血管生成因子表達(dá)和血管形成，且抑制p38-MAPK信號可以增強(qiáng)誘導(dǎo)血管生成作用。不僅為DPSCs中的血管生成機(jī)制提供了新認(rèn)識，還為牙髓再生提供了新策略。

5 小 結(jié)

綜上所述，外泌體的研究為未來醫(yī)學(xué)提供著越來越多的可能性，對包括骨、皮膚、血管和神經(jīng)在內(nèi)的各種口腔頜面部組織的再生均有效且有益，但外泌體是否可以完全替代干細(xì)胞療法，應(yīng)進(jìn)行更系統(tǒng)的研究和評估。在過去的十年中，干細(xì)胞在人類疾病治療中的應(yīng)用引起關(guān)注，但移植的MSC會導(dǎo)致免疫排斥、遺傳不穩(wěn)定或功能喪失，外泌體作為無細(xì)胞療法的介質(zhì)，能夠有效改善MSC移植的不良問題。作為旁分泌介質(zhì)，外泌體在很大程度上可以概括親代細(xì)胞的治療效果，且目前MSC能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)[53]，但外泌體在臨床治療上的安全性和有效性有待進(jìn)一步研究，因此，在對外泌體進(jìn)行設(shè)計和應(yīng)用的同時，應(yīng)做到特征明確；其次，需要對外泌體的miRNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行表征，并間接確定受到影響的細(xì)胞途徑，揭示其內(nèi)容物對受體細(xì)胞的真正意義。相對于干細(xì)胞的生產(chǎn)、儲存、處理等的潛力而言，外泌體可能具有較大優(yōu)勢，隨著學(xué)者們的不斷探索和驗證，外泌體將為再生醫(yī)學(xué)提供新思路。