克氏原螯蝦腸道產植酸酶菌的篩選、鑒定、酶學性質及固態(tài)發(fā)酵研究

張紫娟，鄭苗欣，鄧威，饒俊輝，趙青，凌潔玉

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北 武漢 430205）

植酸是多種植物組織中磷的主要儲存形式，不能被單胃動物消化。飼料中沒有被充分利用的磷，排泄進入環(huán)境會導致水體富營養(yǎng)化[1]。植酸還可以螯合金屬離子，降低礦物元素在動物腸道中的利用率[2]，影響胃腸道消化酶的活性和蛋白質的利用率[3]。向飼料中添加植酸酶可以有效解決上述問題，目前由真菌所產酸性植酸酶已較好地應用于陸生動物中，但細菌所產中性植酸酶在水產養(yǎng)殖中并未廣泛應用[3,4]。這些產植酸酶細菌一般分離自土壤而并非動物，不同水產動物的胃腸道具有差異性[3]。

克氏原螯蝦Procambarus clarkii（俗稱小龍蝦）是重要的淡水特色水產品，經濟價值較高。本研究從小龍蝦腸道中分離產植酸酶菌株，篩選出了產酶兼抑菌特性的潛在益生菌，通過固態(tài)發(fā)酵制成同時含有植酸酶和菌體活細胞的產品，促進開發(fā)小龍蝦新型飼料添加劑以及植酸酶在水產中的運用。

1 材料與方法

1.1 材料

主要原料及試劑：小龍蝦購于某農貿市場；麩皮購于淘寶綠牧生態(tài)養(yǎng)殖店；植酸鈣、植酸鈉、鉬酸銨、偏釩酸銨、無水乙酸鈉等化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母膏等培養(yǎng)基成分購于北京奧博星生物技術有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。

（1）產酶固體篩選培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，胰蛋白胨25 g，植酸鈣5 g，瓊脂20 g，NH4NO35 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO40.01 g，F(xiàn)eSO40.03 g，KCl 0.5 g，水1 000 mL，pH7.0～7.4。121℃滅菌20 min。

（2）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，酵母膏5 g，胰蛋白胨20 g，NH4NO35 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO40.03 g，KCl 0.1 g，NaCl 0.3 g，CaCl22 g，K2HPO40.04 g，水1 000 mL，pH7.0。121℃滅菌20 min。

（3）固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50 g，蒸餾水35 mL，胰蛋白胨0.75 g，NH4NO30.25 g，CaCl20.1 g，MgSO4·7H2O 0.015 g，K2HPO40.002 g；混合均勻，裝入500 mL 錐形瓶中，以4 層紗布封口，121 ℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 小龍蝦腸道產植酸酶菌的篩選及鑒定

無菌解剖小龍蝦，取消化道剪碎后制成懸液，涂布在篩選平板上，37℃培養(yǎng)48～72 h。挑取有水解圈的菌落進行復篩、純化和保藏，進行革蘭氏染色和分子生物學鑒定。采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，通用引物為27F 與1492R，PCR 條件為：94℃預變性5 min；30 個循環(huán)（94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min）；72℃延伸10 min。產物測序結果于NCBI 數(shù)據(jù)庫進行對比。

1.2.2 植酸酶活性測定

按照GB/T 18634-2009[5]方法測定無機磷的標準曲線。采用偏釩酸銨法測定植酸酶活性[6]。以37℃、pH5.5 條件下，1 min 從2.5 mmol/L 植酸鈉溶液中水解釋放l nmol 無機磷所需要的酶量定義為一個酶活單位，以U 表示。

1.2.3 抑菌試驗

副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus 和嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila 培養(yǎng)液稀釋10 倍，分別取400 μL 涂布平板。分別取Z4、Z11 無細胞上清液以及發(fā)酵菌液，以250 μL 注入牛津杯，于合適溫度下培養(yǎng)48 h，測定其抑菌圈直徑。以無菌蒸餾水作為對照。

1.2.4 植酸酶的酶學性質

液體發(fā)酵培養(yǎng)22 h 的Z11 菌液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液即為粗酶液。將粗酶液與底物分別在不同溫度（30℃、35℃、37℃、40℃、45℃和50℃）及不同pH（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.5）條件下反應，測定其酶活力，其中pH4.5～6.5 采用乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH7.0～8.5 采用Tris-HCl 緩沖液。

將不同金屬鹽（CaCl2、MgSO4·7H2O、KCl、NaCl、MnSO4、FeSO4·7H2O）加入酶促反應體系，使得各金屬離子終濃度為5 mmol/L，測定各金屬離子對酶活力的影響。

1.2.5 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗：初始條件為：添加0.03%的MgSO4·7H2O，接種量7%，30℃發(fā)酵36 h。分別改變發(fā)酵時間為16 h、24 h、36 h、48 h 和60 h，發(fā)酵溫度為25℃、30℃、34℃和37℃，接種量為3%、5%、7%、9%和11%，MgSO4·7H2O 添加量為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。測定各條件下產植酸酶活性和芽孢桿菌數(shù)。

（2）正交試驗：在單因素試驗基礎上，每個因素選取3 個水平，采用L9（34）正交表進行正交試驗。

2 結果與分析

2.1 小龍蝦腸道產植酸酶菌的篩選、鑒定及比較

從小龍蝦腸道中共分離出8 株產植酸酶菌株，其水解圈直徑/菌落直徑（D/d）見表1。16S rDNA 分析顯示：Z2 為寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas，Z5為頭狀葡萄球菌Staphylococcus capitis，Z3、Z6、Z8、Z9 為 克 雷 伯 氏 菌 屬Klebsiella pneumoniae，Z4 與Z11 為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。已有研究表明，蠟樣芽孢桿菌為水產養(yǎng)殖中的潛在益生菌[7,8]。分離自凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 腸道的蠟樣芽孢桿菌PC456 能顯著降低對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境中細菌總數(shù)及弧菌數(shù)[8]；而張洪玉等[9]的急性毒性試驗表明，蠟樣芽孢桿菌D7 未對凡納濱對蝦產生明顯毒性。故選擇Z4 與Z11 進行后續(xù)研究。

由表2 可知：在菌體濃度為109CFU/mL 時，Z11產植酸酶的酶活遠高于Z4。抑菌試驗表明，Z11 對副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌兩種病原菌[10]的抑制能力均高于Z4，且Z11 的活菌菌液作用要優(yōu)于其發(fā)酵上清液，提示該蠟樣芽孢桿菌主要通過占位效應成為優(yōu)勢菌群，通過競爭營養(yǎng)物質和生存空間等來抑制病原菌的生長[7]。綜上所述，Z11 為最優(yōu)候選菌株。

2.2 Z11 所產植酸酶的酶學性質

由圖1 可知，無機磷濃度與吸光度間線性關系良好，回歸方程為y=0.2703x－0.0341，R2=0.9903。

由圖2 可知，Z11 所產植酸酶的最適溫度為35～37℃，與大部分報道的芽孢桿菌植酸酶最適溫度在55℃左右不同[11]。小龍蝦的最適生長水溫在20～32℃，該酶的最適溫度較低，能更好地發(fā)揮作用。由圖3 可知，該植酸酶的最適pH 為5.5，不同于報道中絕大部分細菌植酸酶的最適pH 在6.0～7.5之間[11]。與大多數(shù)無胃淡水魚類不同，蝦類的消化道前腸部分具有胃的結構，但其幾乎不分泌胃酸。有研究表明：蝦的消化道pH 呈弱酸性[12]，南美白對蝦胃組織內pH 為5.2 左右，肝胰臟pH 為6.0 左右，中腸道pH 為6.8 左右[12]，。由此推測，小龍蝦攝食該植酸酶與飼料后，能在胃中較好地發(fā)揮作用，降解飼料中的植酸鹽，而到達肝胰臟和腸道時也能保持45%以上的酶活。

由圖4 可知，與大量研究一致[11]，Ca2+能提高植酸酶的酶活，而Mg2+對該酶激活作用更強烈，能提高酶活80%以上，這在報道中比較少見，顯示該酶具有一定特殊性。Mn2+、Fe2+、K+和Na+抑制了該植酸酶的活性，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中不再添加這些金屬鹽。

表1 各菌株的產酶鑒定及16S rDNA 分析結果Tab.1 Identification and 16S rDNA analysis of each phytase-producing bacterium strain

表2 Z4 與Z11 酶活力及抑菌效果比較Tab.2 Comparison of enzyme activities and antibacterial effects between Z4 and Z11 strains

2.3 Z11 固態(tài)發(fā)酵的單因素試驗

由圖5 可知，發(fā)酵36h 時，Z11 菌數(shù)和所產酶的活性達最高值。發(fā)酵前期營養(yǎng)條件充足，細胞生長繁殖迅速，開始產植酸酶，并隨著菌數(shù)增長植酸酶活性也增長，而36h 后，細菌逐漸進入衰亡期，菌數(shù)和酶活迅速下降，其產酶模式為同步合成型。與其他芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵不同[13]，該菌生長繁殖十分迅速，發(fā)酵時間對其生長繁殖影響顯著，在正交試驗選擇時間水平時，應縮短其時間間隔。

由圖6 可知，34℃時Z11 菌數(shù)達最大值，而酶活在30℃最高，到34℃略有下降，這與許多報道一致，細菌的最適產酶溫度略低于其最適生長溫度[6]。

由圖7 可知，接種量為3%～7%時，酶活力平緩上升，而菌數(shù)則顯著上升，接種量為7%時菌數(shù)和酶活力最優(yōu)。接種量過高時，其所需營養(yǎng)大于培養(yǎng)基所能提供的營養(yǎng)，菌體活力下降，酶產量也隨之減少。

由圖8 可知，硫酸鎂添加量對Z11 菌數(shù)影響不大，基本都維持在109CFU/g 以上，低濃度添加量時菌數(shù)更高，而添加量為0.01%時酶活最高。該添加量與王文君等[14]所報道的培養(yǎng)基中加入5 mmol/L Mg2+能提高植酸酶產量基本吻合。當Mg2+過高時，酶活反而會下降，這表明，盡管Mg2+對該酶有較明顯的激活作用，但并不是濃度越高越好，在發(fā)酵培養(yǎng)基中其最適添加量低于在酶促反應中的添加量。

2.4 Z11 固態(tài)發(fā)酵的正交試驗

綜合單因素試驗結果，對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、硫酸鎂添加量4 個因素各選擇3 個水平，設計了L9（34）正交試驗（表3），結果見表4。

由表4 可知，以植酸酶活力為考察指標，極差R 值大小順序為：RA＞RB＞RD＞RC，即各因素對酶活的影響次序為：發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞硫酸鎂添加量＞接種量。由表5 方差分析可知，發(fā)酵時間對酶活力影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵溫度影響顯著（P＜0.05），其他兩因素影響均不顯著（P＞0.05）。K 值分析顯示，產酶最優(yōu)組合為A2B1C3D1，該組合不在9 組正交試驗中，需要進行驗證。以菌數(shù)為考察指標，影響次序為發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞接種量＞硫酸鎂添加量，但表5 顯示，四個因素對菌數(shù)的影響均不顯著（P＞0.05）。K 值表明，菌數(shù)的最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即正交試驗第9 組，其菌數(shù)最高，但其酶活卻非常低，故不合適。

綜合酶活力與菌數(shù)兩個指標考慮，由于發(fā)酵時間與溫度對酶活力影響均顯著，而對菌數(shù)影響均不顯著，故選擇其對酶活的最優(yōu)組合A2B1。硫酸鎂對菌數(shù)和酶活力的影響，最優(yōu)組合均為D1，接種量對菌數(shù)影響更大，故選擇C2，形成組合A2B1C2D1，將該組合與產酶最優(yōu)組合A2B1C3D1一起進行驗證試驗。

由表6 可知：A2B1C3D1酶活為（220.80±5.55）U/g，菌數(shù)為1.6×109CFU/g，均高于所有組合，故最佳固態(tài)發(fā)酵條件為：發(fā)酵36 h，發(fā)酵溫度30℃，接種量7%，MgSO4·7H2O 添加量為0.01%。

麩皮富含植酸鹽，有利于誘導產生細菌植酸酶[6]，是小龍蝦飼料的常用原料，其發(fā)酵物將可作為生物飼料[15]。該發(fā)酵物含有豐富的植酸酶及Z11 活菌，對副溶血弧菌及嗜水氣單胞菌有較好的抑制作用（表6），有利于小龍蝦消化飼料中的植酸，以及抵抗病原菌。

表3 正交因素水平表Tab.3 The factors and levels in the orthogonal test

表4 正交試驗結果及分析Tab.4 Results and analysis of the orthogonal test

表5 正交試驗結果方差分析Tab.5 Analysis of variance of orthogonal test results

表6 驗證試驗Tab.6 Results of verification test

3 討論

我國微生態(tài)制劑在水產養(yǎng)殖中的發(fā)展和應用滯后于陸生動物，其菌種受陸生動物的產品制約，缺乏針對性，很多菌株并不適合在水產動物消化道及養(yǎng)殖水體中增殖[16,17]。如蝦類的消化道既不同于陸生動物呈酸性，也不同于無胃魚類呈中性，因此迫切需要針對特定的水產動物，挖掘宿主來源的土著菌群[18]。目前報道，水產動物大多適合采用芽孢桿菌所產中性植酸酶，但這些芽孢桿菌大都分離自土壤[3]，極少從水產動物的胃腸道分離獲得。本研究首次從小龍蝦消化道分離鑒定得到產植酸酶的蠟樣芽孢桿菌Z11，其最適溫度為37℃，最適pH 為5.5，Mg2+對其有很強激活作用。這些性質均不同于以往分離自土壤的產中性植酸酶芽孢桿菌，推測其能更好適應小龍蝦的胃腸道。Z11 對小龍蝦的主要病原菌副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌均有較強抑制作用。本研究室研究還表明，Z11 能較好地降解模擬小龍蝦養(yǎng)殖水體中的淀粉、蛋白質、氨氮及亞硝氮，預計能進行綜合應用。本研究對水產動物土著菌群的發(fā)掘具有一定指導作用。

優(yōu)化微生物發(fā)酵產酶的發(fā)酵條件時，通常只評價酶活一個指標[13,14]。事實上，微生物活細胞數(shù)量與產酶大都呈現(xiàn)一致性[15]，而產酶菌株大多數(shù)都是益生菌，兼具其他益生特性。本研究中，Z11 除了具有良好產酶能力，其活菌還對小龍蝦的病原菌有較強抑制作用，為此筆者對固態(tài)發(fā)酵設置植酸酶活與活菌數(shù)兩個指標，這在以往的發(fā)酵中也較少見。綜合評定后得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間36 h，溫度30 ℃，接種量7%，MgSO4·7H2O 添加量為0.01%，所得產品酶活為220.80 U/g，活菌數(shù)為1.6×109CFU/g，對副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈分別為15.25 mm、11.25 mm，為兼具酶活與抗菌活性的新型微生態(tài)制劑。當然，其添加進飼料后能否對小龍蝦的消化以及抵制病原菌產生顯著效應，還有待于后續(xù)進一步研究。本研究對小龍蝦新型飼料添加劑的開發(fā)具有重要意義。