山羊ADCY1和CYM基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析

李昆諭 洪瓊花 陶林 江炎庭 歐陽依娜 儲明星 劉玉芳

摘要 [目的]分析腺苷酸環(huán)化酶1（ADCY1）和胰凝乳蛋白酶（CYM）基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與山羊產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)。[方法]通過 MassARRAYSNP分型技術(shù)對ADCY1和CYM基因SNPs位點進(jìn)行分型，檢測其在云上黑山羊（n=544）、濟寧青山羊（n=133）和遼寧絨山羊（n=91）3個群體中的遺傳學(xué)特征，并將其多態(tài)性與產(chǎn)羔性能（產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重、斷奶窩重）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。[結(jié)果]群體遺傳學(xué)結(jié)果表明，ADCY1基因4個突變在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均為低度多態(tài)（PIC≤0.25）;CYM基因g.87624254G>A和g.87627082G>A 2個位點在3種山羊中均為中度多態(tài)（0.25<PIC<0.50）;卡方檢驗顯示，除ADCY1 g.43996583C>T在遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.05），ADCY1基因其余位點和CYM基因g.87624269 G>A、g.87627082G>A 2個位點在3個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，在云上黑山羊中ADCY1基因g.43979904G>A、g.43974472G>A，CYM基因g.87624254G>A位點多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）;ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T，CYM基因g.87624254G>A、g.87627082G>A位點多態(tài)性與初生窩重存在顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）。[結(jié)論]ADCY1基因g.43974472G>A和g.43979904G>A位點可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T位點，CYM基因g.87627082G>A位點可作為云上黑山羊初生窩重選擇的潛在分子標(biāo)記;CYM基因g.87624254G>A位點可作為云上黑山羊窩重選擇的潛在分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 山羊;產(chǎn)羔數(shù);窩重;ADCY1基因;CYM基因

中圖分類號 S827? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）24-0141-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.033

Polymorphism of Goat ADCY1 and CYM and Its Association with Litter Size

LI Kun-yu1， 2， HONG Qiong-hua3， TAO Lin2 et al

（1. College of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan， Hebei 056001;2. Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193;3.Yunnan Animal Science and Veterinary Institute， Kunming， Yunnan 650224）

Abstract [Objective]This study aimed to analyze the association between single nucleotide polymorphisms （SNPs） in the adenylate cyclase 1 （ADCY1） and chymotrypsin （CYM） genes and kidding performance in goats.[Method]MassARRAYSNP typing technology was applied to genotype the SNPs of ADCY1 and CYM genes and detect their genetic characteristics in Yunshang black goat （n=544）， Jining grey goat （n=133） and Liaoning cashmere goat （n=91）. Then the association was analyzed between ADCY1 and CYM and kidding performance （litter size， litter weight at birth， litter weight at weaning） in different goats. [Result]The results of population genetics showed that the 4 mutations of ADCY1 gene were low polymorphisms in Yunshang black goat， Jining grey goat， and Liaoning cashmere goat （PIC≤0.25）;CYM gene g.87624254G>A and g.87627082G>A both candidate locus were moderately polymorphic in the three goats （0.25<PIC<0.5）. Chi-square test showed that， except ADCY1 g.43996583C>T in Liaoning cashmere goats， which is in Hardy-Weinberg imbalance （P<0.05）， the other locus are in Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）;CYM gene g.87624269 two locus G>A and g.87627082G>A were in Hardy-Weinberg equilibrium in the three populations （P>0.05）. The results of association analysis showed that in Yunshang black goats， the ADCY1 gene g.43974472G>A， g.43979904G>A， and CYM gene g.87624254G>A polymorphisms were significantly associated with litter size （P<0.05）;ADCY1 gene g.43996550G>A， g.43996583C>T， CYM gene g.87624254G>A， g.87627082G>A polymorphisms were significantly associated with the primary litter weight （P<0.05）. [Conclusion]In summary， ADCY1 gene g.43974472G>A and g.43979904G>Acan be used as a potential molecular marker for litter size in Yunshang black goats.ADCY1 geneg.43996550G>A and g.43996583C>T locus， CYM gene g.87627082G>A locus can be used as potential molecular markers for litter weight at birth in Yunshang black goats; CYM gene g.87624254G>A locus can be used as potential molecular markers for litter weight selection in Yunshang black goats.

Key words Goat;Litter size;Litter weight;ADCY1 gene;CYM gene

基金項目 國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-38）;河北省自然科學(xué)基金青年項目（C2019402261）;云南省科技創(chuàng)新人才計劃（2018HC017）;云南省萬人計劃——產(chǎn)業(yè)技術(shù)領(lǐng)軍人才項目;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ZDRW202106和ASTIP-IAS13）。

作者簡介 李昆諭（1996—），男，甘肅定西人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種;洪瓊花（1968—），女，云南鶴慶人，研究員，從事羊遺傳育種研究。李昆諭和洪瓊花為共同第一作者。通信作者：儲明星，研究員，從事羊優(yōu)異繁殖性狀分子機理研究;劉玉芳，博士，從事動物遺傳育種研究。

收稿日期 2021-04-12

山羊（Capra hircus）又稱夏羊，是最古老的馴養(yǎng)動物之一[1]。馴化的山羊可為人類提供肉、奶、皮、毛等主要生活資料，在人類農(nóng)業(yè)文明和經(jīng)濟發(fā)展中起著重要作用。產(chǎn)羔數(shù)是一個復(fù)雜的性狀，受到多種因素的影響，且產(chǎn)羔數(shù)是一個遺傳力較低（0.1左右）的性狀，是一個受多個基因控制的復(fù)雜的閾性狀[2-3]。利用傳統(tǒng)的育種手段在短時間內(nèi)難以快速對其進(jìn)行改良[4-5]。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，可為快速、高效地改良山羊產(chǎn)羔性狀提供有效位點，顯著提高產(chǎn)羔性狀選擇效率，加快育種進(jìn)程，為進(jìn)一步解析山羊高繁殖力形成的分子機理提供理論基礎(chǔ)。

腺苷酸環(huán)化酶1（adenylate cyclase 1，ADCY1）是ADCY蛋白的家族成員，定位于山羊4號染色體上，擁有20個外顯子。在有機體內(nèi)，ADCY1負(fù)責(zé)將ATP催化成環(huán)AMP（cAMP），cAMP作為輔助因子參與細(xì)胞活動的多種進(jìn)程[6-7]。Buell等[8-9]研究表明，cAMP可影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的過程，其濃度可以影響卵母細(xì)胞成熟，進(jìn)而影響胚胎的質(zhì)量。Islam等[10]研究表明，在6個中國山羊品種中ADCY1被特異性選擇，并與山羊的繁殖力顯著相關(guān)。胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin，CYM）具有9個外顯子，定位于山羊3號染色體上，其功能與胰蛋白酶相似，都屬參與蛋白質(zhì)氨基酸代謝酶，也是一種水解酶。在檢測與胰腺分泌功能不全相關(guān)聯(lián)的胰腺疾病的篩選試驗方面有一定的應(yīng)用，然而其對動物生殖的作用尚鮮見報道[11]。Lai等[12]通過對2個品種奶山羊全基因組深度測序篩選到了與產(chǎn)羔性狀顯著相關(guān)的重要候選基因CYM 。該研究利用前期對云上黑山羊（云上黑山羊是以云嶺山羊為母本、努比山羊為父本培育而成的我國第一個肉用黑山羊品種[13-14]）的重測序結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)閱讀，推測ADCY1和CYM基因可能對山羊產(chǎn)羔數(shù)有一定的影響，在前期數(shù)據(jù)結(jié)果中篩選出與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的8個SNPs位點，其中，在ADCY1基因的SNPs分別為g.43974472G>A、g.43979904G>A、g.43996550G>A和g.43996583C>T，CYM基因的SNPs分別為g.87621057G>A、g.87624254G>A、g.87624269G>A和g.87627082G>A，采用 MassARRAYSNP分型技術(shù)，在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊群體中對候選基因的基因型進(jìn)行檢測，分析其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)性，以期為山羊的高繁殖力分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

共采集768只山羊（2～5歲）的血液，其中云上黑山羊544只，濟寧青山羊133只，遼寧絨山羊91只（表1）。將濟寧青山羊視為高繁殖力群體，遼寧絨山羊視為低繁殖力群體[13-14]。所有試驗用山羊飼養(yǎng)條件環(huán)境一致，云上黑山羊擁有至少1胎產(chǎn)羔數(shù)記錄，部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3月齡）記錄，所有羊均采用頸靜脈采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 血液DNA的提取

試驗樣本使用酚氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3 基因分型

采用Sequenom MassARRAYSNP分型技術(shù)對ADCY1基因和CYM基因突變位點進(jìn)行檢測，相關(guān)引物信息見表2。分型樣品為DNA，每個樣品需要量為20 μL，DNA濃度為40～80 ng/μL。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Microsoft Excel 2020軟件統(tǒng)計山羊ADCY1和CYM基因突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用 IBM SPSS Statistics 25軟件中的一般線性模型，多重比較采用LSD法，對山羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（**P<0.01，*P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADCY1基因多態(tài)性分析

利用Sequenom MassARRAYSNP對768只山羊血液DNA進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示，ADCY1基因4個SNPs位點在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中存在多態(tài)性，其中g(shù).43974472G>A、g.43979904G>A和g.43996550G>A位點基因型為GG、GA、AA，g.43996583C>T位點基因型為CC、CT、TT（圖1）。

統(tǒng)計濟寧青山羊（高繁）和遼寧絨山羊（低繁）品種ADCY1基因4個SNPs位點的基因型頻率和等位基因頻率（表3），ADCY1基因g.43979904 G>A和43996550 G>A位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05），且高繁群體和低繁群體的優(yōu)勢基因型均為GG，優(yōu)勢等位基因為G;g.43996583 C>T位點的基因型頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

群體遺傳學(xué)統(tǒng)計表明，ADCY1基因4個突變在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均為低度多態(tài)（PIC≤0.25）?？ǚ竭m應(yīng)性檢驗結(jié)果表明，除ADCY1g.43996583C>T在遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P<0.05）外，ADCY1其余位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）（表4）。

2.2 CYM基因多態(tài)性分析

基因分型結(jié)果表明（圖2），CYM基因4個候選位點在3個群體中均存在多態(tài)性。其中，CYM基因g.87624254G>A和g.87627082G>A 2個位點在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中存在GG、GA 和AA 3種基因型（表4）。

由表3可知，CYM基因g.87621057G>A和g.87624269G>A位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均達(dá)到顯著水平（P<0.05），但g.87627082G>A位點的基因型頻率和等位基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異均不顯著。其中g(shù).87624254G>A 和g.87627082G>A位點在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢基因型為GA，g.87621057G>A和g.87624269G>A位點在高繁和低繁山羊群體中的優(yōu)勢基因型為GG，優(yōu)勢等位基因均為G。

由表4可知，CYM基因g.87624254G>A和g.87627082G>A 2個候選位點在3種山羊中均為中度多態(tài)（0.25<PIC<0.50），CYM基因g.87624269G>A在3種山羊中均為低度多態(tài)（PIC≤0.25）?？ǚ綑z驗表明，CYM基因g.87624269 G>A和g.87627082G>A 2個位點在3個群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

2.3 候選SNPs位點與云上黑山羊繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

ADCY1基因g.43974472G>A位點AA型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG型（P<0.05），ADCY1基因g.43979904G>A位點GG和GA型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA型（P<0.05）（表5）。CYM基因g.87624254G>A位點GG型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GA型（P<0.05）。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T，CYM基因g.87627082G>A 位點多態(tài)性與云上黑山羊初生窩重存在顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）。CYM基因g.87624254G>A位點多態(tài)性與云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重存在顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）。

3 討論

3.1 ADCY1基因與生殖性狀的關(guān)系

cAMP作為第二信使的一種，是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動組成部件之一，與細(xì)胞活動及生殖密切相關(guān)[8，15-17]。Chang等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制cAMP表達(dá)可使芳香化酶的表達(dá)降低，從而影響顆粒細(xì)胞的生長發(fā)育，ADCY1作為cAMP形成所必需的物質(zhì)，對于細(xì)胞活動尤為重要[20]。因此，ADCY1基因與動物的生殖過程息息相關(guān)，或可作為研究動物生殖過程的一個標(biāo)記。

3.2 ADCY1和CYM基因多態(tài)性及其與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、窩重之間的關(guān)系

目前，關(guān)于ADCY1和CYM基因與山羊產(chǎn)羔數(shù)之間關(guān)系的報道較少。該試驗發(fā)現(xiàn)，ADCY1基因g.43974472G>A位點AA型個體產(chǎn)羔數(shù)高于GG型個體0.32只，GA型個體產(chǎn)羔數(shù)高于GG型0.07只，筆者推測該位點G>A的突變或是一個優(yōu)良的突變。ADCY1基因g.43979904G>A位點G>A的突變導(dǎo)致其產(chǎn)羔數(shù)下降，推測該位點G>A的突變或是一個不利的突變。ADCY1基因g.43996550G>A和g.43996583C>T位點的突變性都與云上黑山羊的初生窩重顯著相關(guān)，或可作為篩選云上黑山羊初生窩重的潛在分子標(biāo)記。

CYM基因g.87624254G>A位點GG型個體相比GA型產(chǎn)羔數(shù)高出0.17只，而GA型個體初生窩重顯著高于GG型，因此該突變位點還可能需要進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。CYM基因g.87627082G>A位點初生窩重雜合型個體顯著高于純合型個體，或可作為篩選云上黑山羊初生窩重的潛在分子標(biāo)記。綜上所述，ADCY1基因g.43974472G>A和g.43979904G>A位點或可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T位點，CYM基因g.87627082G>A位點或可作為云上黑山羊初生窩重的潛在分子標(biāo)記，g.87624254G>A位點可作為云上黑山羊窩重選擇的潛在分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

ADCY1基因g.43974472G>A和g.43979904G>A位點與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T位點，CYM基因g.87627082G>A位點與云上黑山羊初生窩重存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊初生窩重選擇的潛在分子標(biāo)記。CYM基因g.87624254G>A位點與云上黑山羊初生窩重和斷奶窩重存在顯著關(guān)聯(lián)，可作為云上黑山羊窩重選擇的潛在分子標(biāo)記。

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