沿階草體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及快繁技術(shù)研究

梁慧敏 杜雪玲 夏陽 施昌倩

摘要 ?[目的]探究沿階草體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及快繁技術(shù)。[方法]以3份沿階草種質(zhì)Nanus、Arabicus和Wild為試驗(yàn)材料，研究不同外植體、不同光照條件、不同植物激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生和體細(xì)胞胚成熟的影響。[結(jié)果]3份沿階草種質(zhì)中，幼莖和葉基為外植體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率均為最高;以沿階草葉基為外植體，黑暗條件下的愈傷組織誘導(dǎo)率最高;2，4-D是沿階草愈傷組織誘導(dǎo)與初生體細(xì)胞胚的發(fā)生關(guān)鍵激素，而NAA和6-BA與次生體細(xì)胞胚形成、體細(xì)胞胚成熟相關(guān)，其中將初生體細(xì)胞胚置于添加0.5 mg/L NAA和2.0 mg/L 6-BA的MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d，可獲得8～13倍的次生體細(xì)胞胚;將成熟的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入MS0培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d可獲得具有根和葉的完整植株。[結(jié)論]該研究可為沿階草規(guī)模化繁殖和推廣提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞 沿階草;愈傷組織;體胚發(fā)生;再生;快繁

中圖分類號(hào) S688.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）24-0136-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.032

A Rapid Propagation Protocol of Ophiopogon japonicus via Somatic Embryo Culture in vitro

LIANG Hui-min1，DU Xue-ling2，XIA Yang3 et al （1.Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry， Jurong， Jiangsu 212400;2.College of Life Sciences， Huaibei Normal University， Huaibei， Anhui 235000;3.Shandong Academy of Forestry Sciences，Jinan，Shandong 250014）

Abstract [Objective]To study rapid propagation protocol of Ophiopogon japonicus via Somatic Embryo culture in vitro. [Method]Taking O. japonicus germplasms Nanus， Arabicus and Wild were used as experiment materials， effects of different explants， different light conditions， and different phytohormone ratios on callus induction， somatic embryogenesis， and somatic embryo maturation were investigated. [Result]The results showed that leaf base and young stem as explants produced significantly higher calli induction rate in all three cultivars. The highest calli induction rate from young stem was obtained under dark condition. 2，4-Dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） was essential for calli induction and somatic embryogenesis of O. japonicus. Both NAA and 6-BA synergistically promoted secondary embryos development and maturation. We can produce a lot of plantlets of O. japonicus through secondary embryos culture in vitro on Murashige and Skoog （MS） medium supplemented with 0.5 mg/L NAA and 2.0 mg/L 6-BA， reaching to 8-13-fold per 25 days. Finally， the complete plantlets with leaves and roots were produced by transferring maturation somatic embryos into MS0 medium for 30 days. [Conclusion] The results can provide a technical support for large-scale propagation and popularization of O. japonicus.

Key words Ophiopogon japonicus;Callus;Somatic embryogenesis;Regeneration;Rapid propagation

基金項(xiàng)目 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)科技創(chuàng)新類項(xiàng)目（2017kj09）;安徽省重點(diǎn)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202004a06020046）;江蘇省草坪草種質(zhì)資源庫。

作者簡介 梁慧敏（1962—），女，寧夏銀川人，教授，博士，從事草坪分子遺傳育種研究。

收稿日期 2021-04-01

沿階草（Ophiopogon japonicus）又名麥冬，屬于百合科（Liliaceae）沿階草屬（Ophiopogon）多年生草本單子葉植物，因其具有株型低矮、常綠、耐熱、耐寒、耐旱、耐陰和耐貧瘠等特性，常被作為地被和邊緣景觀營造中的綠地材料[1-2]。藥理研究顯示，沿階草富含皂苷、黃酮類、氨基酸、多糖和維生素等物質(zhì)，對(duì)咳嗽、糖尿病、胃炎、癌癥等疾病有一定治療作用[3-5]，可見沿階草是重要的觀賞兼藥用的經(jīng)濟(jì)植物。但是，沿階草主要依靠分離母株根狀莖萌發(fā)的幼苗進(jìn)行繁殖[6]，這種方式繁殖效率較低，難以滿足國內(nèi)外綠化產(chǎn)業(yè)和藥用產(chǎn)業(yè)市場擴(kuò)大的種植需求。同時(shí)，分株繁殖還普遍存在病害侵染、生長緩慢等問題[7]，嚴(yán)重影響沿階草的成苗和品質(zhì)。利用植物組織培養(yǎng)和基因工程技術(shù)[8-9]，不僅可以顯著提高沿階草繁殖系數(shù)，還可以增強(qiáng)其抗逆性和抗病蟲害能力，進(jìn)而提升其產(chǎn)苗量和品質(zhì)。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑是微繁殖和基因遺傳轉(zhuǎn)化受體體系建立的途徑之一[10]。近年來，體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的微繁殖體系建立已成功應(yīng)用于百合[11]、馬尾松[12]、白刺花[13] 和棗[14]等園藝植物上。目前國內(nèi)外有關(guān)沿階草的微繁殖研究多以愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的器官發(fā)生途徑獲得再生苗[8，15-17]，但以體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的研究鮮有報(bào)道[7]。

該研究分別從不同沿階草種質(zhì)、不同外植體材料（葉片、幼莖和根）、不同光照條件以及不同植物激素配比等影響因子方面，探討篩選誘導(dǎo)沿階草胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚的最適培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，以期建立沿階草離體培養(yǎng)高頻植株再生體系，為沿階草離體快繁的工廠化生產(chǎn)模式建立及其種質(zhì)改良與創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以江蘇省草坪草種質(zhì)資源圃收集保存的2份引進(jìn)矮生沿階草（Ophiopogon japonicus cv.Nanus，Nanus）、黑沿階草（Ophiopogon planiscapus cv.Arabicus，Arabicus）及1份野生細(xì)葉沿階草（Ophiopogon spp，Wild）種質(zhì)為試驗(yàn)材料。

1.2 無菌外植體的獲取

挑選生長健壯、無病斑的植株，流水沖洗數(shù)遍后，剪去基部的根和老莖段，去除老葉，然后分別將幼嫩的幼莖、葉片和根，用洗滌劑浸泡10 min，無菌水沖洗5次，再用2%次氯酸鈉（NaClO）溶液消毒15 min，在消毒過程中將消毒瓶置于電磁攪拌器上進(jìn)行攪拌，以去除外植體上的氣泡，提高滅菌效果。最后，消毒材料經(jīng)無菌水沖洗5次后，移至超凈工作臺(tái)中，用70%乙醇處理20 s，0.1%氯化汞表面滅菌8 min，無菌水沖洗5次后，再用無菌濾紙吸干水分，備用。

1.3 篩選愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體

參考 Karamian 等[18]和Karalija等[11]報(bào)道的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)配方，將消毒后的葉片橫切成2 mm × 4 mm條狀的頂端葉片、中間葉片和基部葉片，并將幼莖和根尖切成2～3 mm的小段，然后分別接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 0.5 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L NAA + 0.1 mg/L 6-BA + 30 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂上（pH=5.8），溫度（25±1） ℃，光周期為14 h，光照強(qiáng)度為500 lx。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。每個(gè)處理每個(gè)種質(zhì)60個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.4 篩選愈傷組織誘導(dǎo)的最適光照強(qiáng)度

以不同沿階草種質(zhì)的葉片基部為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 0.5 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L NAA + 0.1 mg/L 6-BA + 30 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂（pH=5.8），然后分別置于不同光照強(qiáng)度下培養(yǎng)：黑暗（無光）、弱光（500～800 lx）、強(qiáng)光（1 000～1 500 lx），溫度（25±1） ℃，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。每個(gè)處理每個(gè)種質(zhì)60個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.5 不同激素濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和初生體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

以葉片基部為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1上，溫度（25±1） ℃，光周期14 h，光照強(qiáng)度為500 lx。MS1由MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度的2，4-D、NAA和 6-BA、蔗糖 30 g/L和瓊脂7 g/L（pH=5.8）組成（表1）。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。此外，誘導(dǎo)的愈傷組織繼續(xù)用MS1培養(yǎng)基繼代一次，培養(yǎng)60 d后，胚性愈傷組織上會(huì)產(chǎn)生初生體細(xì)胞胚，并統(tǒng)計(jì)初生體細(xì)胞胚發(fā)生率。根據(jù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和萌發(fā)培養(yǎng)基MS0 25 d培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)淺黃色、質(zhì)地松軟、內(nèi)有致密較硬顆粒的胚性愈傷組織為初生體細(xì)胞胚。MS0由MS基本培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L和瓊脂7 g/L（pH=5.8）組成。每個(gè)處理50個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.6 不同激素濃度配比對(duì)次生體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

為了增加沿階草的繁殖系數(shù)，以葉片基部為外植體，將誘導(dǎo)的初生體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接到次生胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2中培養(yǎng)，溫度（25±1） ℃，光周期14 h，光照強(qiáng)度為500 lx。MS2由MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度NAA和6-BA、蔗糖 30 g/L和瓊脂7 g/L（pH=5.8）組成（表2），培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)次生體細(xì)胞胚增殖系數(shù)。每個(gè)處理50個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.7 體細(xì)胞胚成熟和植株再生

將誘導(dǎo)的次生體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上，由MS基本培養(yǎng)基附加NAA 0.5 mg/L、6-BA 2.0 mg/L、蔗糖 30 g/L和瓊脂7 g/L組成，溫度（25±1）℃、光周期為14 h，500 lx，培養(yǎng)25 d后，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷上產(chǎn)生大量的初代、次代和成熟的體細(xì)胞胚（成熟體細(xì)胞胚即新的次生體細(xì)胞胚不再形成）。然后，將成熟的體細(xì)胞胚切成直徑大小為0.5～1.0 mm團(tuán)塊，接種到萌發(fā)培養(yǎng)基MS0上，培養(yǎng)溫度（25±3） ℃，光周期為14 h，光強(qiáng)1 000 lx，培養(yǎng)30 d后，觀察成熟體細(xì)胞胚的生長狀況。

1.8 馴化移栽

挑選上述MS0培養(yǎng)基中生長健壯、根細(xì)長、葉片伸展的沿階草小植株，移至溫室中打開瓶蓋，煉苗2～3 d，然后用自來水小心沖洗培養(yǎng)基，移栽至泥炭、蛭石及園土為3∶4∶3的混合基質(zhì)中，控制室溫在（25±3） ℃，每天噴水保濕，30 d后成活率為100%。

1.9 組織結(jié)構(gòu)觀察

選取不同時(shí)期新鮮的愈傷組織顆粒，進(jìn)行固定、包埋、修邊、切片、染色，然后置于Olympus光學(xué)顯微鏡（BX51，日本）下進(jìn)行照相、觀察、記錄[19]。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel、SPSS 25.0（Armonk，美國）等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。采用最小顯著差數(shù)法（the least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢測（P < 0.05）。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)的愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

體細(xì)胞胚發(fā)生率=誘導(dǎo)的初生體細(xì)胞胚數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

次生體細(xì)胞胚增殖系數(shù)=增殖次生體細(xì)胞胚數(shù)/接種的初生胚狀體數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體和光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從圖1可知，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，不同外植體在不同沿階草種質(zhì)間愈傷組織誘導(dǎo)率無顯著差異，但是同一種質(zhì)不同外植體之間愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異。其中，各沿階草種質(zhì)中幼莖的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，接近100%，其次是葉片基部，其愈傷組織誘導(dǎo)率約80%，最小的為根尖，愈傷組織誘導(dǎo)率約3%。

從圖2可知，不同光照強(qiáng)度下不同沿階草種質(zhì)間葉片基部的愈傷組織誘導(dǎo)率也無顯著差異，但是同一種質(zhì)不同光照強(qiáng)度之間愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異。愈傷組織誘導(dǎo)率從高到低依次為黑暗、弱光、強(qiáng)光條件。

2.2 不同激素濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和初生體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

由表1可知，當(dāng)2，4-D濃度為0 mg/L時(shí)，各種質(zhì)均未誘導(dǎo)出愈傷組織;2，4-D濃度為0.1 mg/L時(shí)，各種質(zhì)的愈傷組織誘導(dǎo)率與初生體細(xì)胞胚發(fā)生率均很低。當(dāng)2，4-D濃度≥0.5 mg/L時(shí)，各組合均能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。通過光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織上有少量的分生細(xì)胞團(tuán)，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大，細(xì)胞排列緊密（圖3A），此時(shí)觀察到少量的體細(xì)胞胚（圖3B）。隨著單個(gè)胚性細(xì)胞進(jìn)入分化期，胚性細(xì)胞的極性表現(xiàn)明顯，頂細(xì)胞分裂形成多細(xì)

胞原胚（圖3A），類似于合子胚發(fā)育形成的球形胚、魚雷胚（圖4A），球形胚繼續(xù)發(fā)育形成棒狀胚（子葉胚）（圖4B），該

類胚狀體在MS0培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可形成再生植株。

由表1可知，3個(gè)沿階草種質(zhì)中，不同激素配比對(duì)葉片基部愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)生存在顯著差異。Nanus中，愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)生的最佳組合為0.5 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA，其愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚發(fā)生率分別為97%和94%;Arabicus的最佳組合為1.0 mg/L 2，4-D、0.1 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA，其愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚發(fā)生率分別為94%和88%;而Wild最佳愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)生組合為0.5 mg/L 2，4-D、0.1 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA，愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚發(fā)生率分別為98%和95%。

2.3 不同激素濃度配比對(duì)次生體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

不同NAA和6-BA濃度7個(gè)組合獲得的次生體細(xì)胞胚增殖試驗(yàn)結(jié)果見表2和圖4C。觀察到各種質(zhì)初生體細(xì)胞胚中產(chǎn)生了許多次生胚狀體，增殖系數(shù)最高達(dá)13.68，且不同種質(zhì)不同組合對(duì)次生體細(xì)胞胚增殖系數(shù)存在顯著差異。其中以0.5 mg/L NAA和2.0 mg/L 6-BA的組合效果最好，Nanus、Arabicus和Wild的增殖系數(shù)分別為11.60、13.68和8.16。

2.4 體細(xì)胞胚成熟和植株再生

將次生體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接到以MS為基本培養(yǎng)基附加NAA 0.5 mg/L和6-BA 2.0 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后，觀察到大部分胚性愈傷組織表面上可直接發(fā)育成完整植株，但幼根不像正常根那樣細(xì)長發(fā)綠，而是細(xì)而短、發(fā)白（圖 4D）。此外，觀察到一部分胚性愈傷組織上會(huì)繼續(xù)產(chǎn)生次生體胚，還有一部分長0.5～1.0 mm的子葉胚，繼代培養(yǎng)時(shí)次生體胚不再形成，視為成熟胚（圖4D）。然后，將成熟胚轉(zhuǎn)移到不添加植物激素的MS0培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，發(fā)現(xiàn)有帶葉和根的完整植株產(chǎn)生（圖4E）。

2.5 再生苗的馴化

當(dāng)再生苗在MS0培養(yǎng)基上生長3～4 cm 時(shí)，移去瓶蓋。在離培養(yǎng)基表面3 mm用自來水澆灌再生植株，以適應(yīng)環(huán)境。將馴化2～3 d的試管苗從培養(yǎng)基中沖洗干凈，移栽到混合基質(zhì)泥炭∶蛭石∶園土（3∶4∶3）中。將花盆移入溫室進(jìn)行生長（圖4F）。共獲得1 421株再生植株。

3 結(jié)論與討論

沿階草是重要的觀賞兼藥用經(jīng)濟(jì)植物，但其制種結(jié)實(shí)率低，傳統(tǒng)的分離母株根狀莖萌發(fā)繁殖方式效率低，需建立高效的沿階草植株再生體系。體細(xì)胞胚只有生理上成熟才有萌發(fā)成再生植株的潛力[20]，一般體細(xì)胞胚發(fā)生受植物的品種、外植體類型、植物激素、培養(yǎng)條件等諸多因素的影響[12-13，21-22]。該研究種質(zhì)間比較發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)的沿階草在不同條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚發(fā)生率存在顯著差異，這與Wu等[23- 24]報(bào)道的結(jié)果一致。觀察發(fā)現(xiàn)不同激素組合中，Wild的愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚發(fā)生率最高，最高分別為98%和95%，Arabicus最低，愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚發(fā)生率最高分別為94%和88%;相反，不同激素組合中，Arabicus次生體細(xì)胞胚增殖系數(shù)明顯高于Wild，Arabicus增殖系數(shù)最高為13.68，而Wild增殖系數(shù)最高為8.16。

外植體是決定愈傷組織誘導(dǎo)、胚發(fā)生和植株再生的另一個(gè)重要因素。據(jù)報(bào)道，植物的葉、根、莖、下胚軸和花蕾等外植體具有形成愈傷組織、產(chǎn)生體細(xì)胞胚和再生植株的能力[24-26]。百合科百合以分生組織為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，并通過器官發(fā)生途徑獲得再生植株[7，11]。該研究發(fā)現(xiàn)，葉頂端、葉中部、根尖對(duì)植物激素誘導(dǎo)愈傷組織不敏感，而葉基部和幼莖可以形成愈傷組織，且愈傷組織誘導(dǎo)率最高。同時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷組織能夠通過體細(xì)胞胚發(fā)生再生植株。因此，葉基部和幼莖是沿階草理想的植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化的外植體材料。

植物激素在愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生中起著重要作用。植物激素的類型、水平和組合是影響愈傷組織形成、胚胎發(fā)生和植株再生的關(guān)鍵因素[11，13，21，24]。該研究結(jié)果表明，2，4-D具備決定沿階草愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚發(fā)生和次生胚形成的能力。此外，體細(xì)胞胚成熟只需要NAA和6-BA 2種植物激素，如果在培養(yǎng)基中添加2，4-D，發(fā)現(xiàn)很少有體細(xì)胞胚能夠成熟和萌發(fā)。因此，筆者認(rèn)為2，4-D是沿階草愈傷組織的誘導(dǎo)與初生體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因素。其次，胚的成熟和植株再生以及次生體細(xì)胞胚的形成與激素NAA和6-BA相關(guān)。該研究中，0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA的MS2培養(yǎng)基培養(yǎng)初生體細(xì)胞胚可獲得8～13倍的次生體細(xì)胞胚。因此，利用以上方法可快速繁殖沿階草種苗，從而滿足市場需求。

此外，該研究還發(fā)現(xiàn)外植體在黑暗或昏暗的光照下均能形成愈傷組織，而在強(qiáng)光下難以形成。因此，筆者認(rèn)為，沿階草細(xì)胞、組織和器官的離體培養(yǎng)中，遮陰（弱光）條件是胚性愈傷組織形成的最佳光照條件。

該研究建立了高效的沿階草體細(xì)胞胚發(fā)生再生體系，將為沿階草離體快繁的工廠化種苗生產(chǎn)、種質(zhì)資源保存、遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯研究奠定了基礎(chǔ)。

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