基于腸道菌群研究?jī)捎H性嵌段共聚物用于湯劑抑苦的適宜性

林俊芝，李 潘，仇 敏，柯秀梅，韓 麗，楊 明，伍振峰*，張定堃*

基于腸道菌群研究?jī)捎H性嵌段共聚物用于湯劑抑苦的適宜性

林俊芝1，李 潘2，仇 敏3，柯秀梅4，韓 麗3，楊 明5，伍振峰5*，張定堃3*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072 2. 成都市青白江區(qū)人民醫(yī)院，四川 成都 610300 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 4. 重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016 5. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

從腸道菌群角度，評(píng)價(jià)兩親性嵌段共聚物用于中藥湯劑抑苦的適宜性和安全性。以苦味強(qiáng)烈的鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BH）溶液為模型藥物，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)比研究?jī)捎H性嵌段共聚物、天然甜味劑（蔗糖）與人工甜味劑（阿斯巴甜）連續(xù)給藥2周后對(duì)大鼠腸道菌群的影響。BH經(jīng)過(guò)兩親性嵌段共聚物、蔗糖、阿斯巴甜掩味后，其物種總數(shù)有升高的趨勢(shì)。兩親性嵌段共聚物不影響B(tài)H菌群的多樣性與群落構(gòu)成；蔗糖具有使BH菌群多樣性升高的趨勢(shì)，阿斯巴甜具有使BH菌群多樣性降低的趨勢(shì)。在長(zhǎng)期服藥條件下，兩親性嵌段共聚物作為湯劑抑苦輔料不干擾藥物對(duì)腸道菌群的作用，對(duì)于兒童用藥是一種更為安全的掩味劑。

中藥湯劑；抑苦；兩親性嵌段聚合物；腸道菌群；湯劑伴侶開(kāi)發(fā)；小檗堿

中藥湯劑普遍苦味重、口感差，嚴(yán)重影響服藥的順應(yīng)性，尤其是兒童人群難以忍受。這與湯劑中苦味成分多以分子態(tài)形式存在、分散度大，能在極短時(shí)間內(nèi)瞬時(shí)完成苦味信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)[1]。目前，甜味劑是應(yīng)用最為廣泛的矯味劑，包括天然甜味劑與人工甜味劑。在普通家庭中，主要添加大量蔗糖干擾湯劑苦味，個(gè)別醫(yī)院藥房有小包裝甜菊素提供，但蔗糖與甜菊素均為天然甜味劑，其矯味效果通常是苦味與甜味的復(fù)合，對(duì)小劑量且苦味不強(qiáng)的藥物有效，但對(duì)大劑量或苦味強(qiáng)烈的藥物效果并不理想。在部分中成藥制劑處方中，有使用三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜等人工甜味劑抑苦的用法[2]。人工甜味劑刺激的甜味感知通路與苦味感知通路相同，常作為抑苦的“特效”物質(zhì)[3]。但最新研究表明，人工甜味劑可能會(huì)引發(fā)腸道菌群的紊亂，影響菌群的代謝通路，增加宿主對(duì)代謝疾病的易感性，尤其是降低腸道菌群葡萄糖耐受性[4-5]。紐甜還可降低菌群多樣性，改變腸道微生物的代謝途徑和糞便代謝物的分布，引起多種脂肪酸、脂質(zhì)和膽固醇升高，蘋(píng)果酸和甘油酸大量減少[6]。因此，人工甜味劑并不適合長(zhǎng)期服用，尤其對(duì)于腸道菌群平衡脆弱的兒童群體，可能是威脅其健康的潛在因素[7-8]。

兩親性嵌段共聚物是指存在兩種或兩種以上結(jié)構(gòu)不同的鏈段的單一線(xiàn)性分子，可根據(jù)需要合成具有特定化學(xué)結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量的共聚物，是一種廣泛應(yīng)用且安全性好的輔料[9-10]。課題組前期發(fā)現(xiàn)兩親性嵌段共聚物是一種液體制劑的新型苦味掩蔽劑，對(duì)于多種結(jié)構(gòu)的苦味成分均有明確的抑苦效果，并可在水中自組裝形成膠束，包裹苦味成分的疏水性苦味基團(tuán)，阻斷苦味基團(tuán)與苦味受體的結(jié)合，達(dá)到掩蔽苦味的目的；同時(shí)，其口服后可在體內(nèi)降解，對(duì)藥物藥效與體內(nèi)吸收過(guò)程無(wú)顯著影響[11-12]。但兩親性嵌段共聚物長(zhǎng)期給藥是否影響腸道菌群的平衡尚不明確，制約了其作為新型抑苦輔料的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。為此，本實(shí)驗(yàn)以苦味強(qiáng)烈的鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BH）溶液為模型藥物，采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)比研究?jī)捎H性嵌段共聚物、天然甜味劑（蔗糖）與人工甜味劑（阿斯巴甜）連續(xù)給藥2周后對(duì)大鼠腸道菌群的影響，以期為兩親性嵌段共聚物進(jìn)一步的抑苦應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Tc-Meter 4K-7.2K離心機(jī)，美國(guó)Topscience公司；Qubit 3.0定量?jī)x，美國(guó)Life technologies公司；CF-F9677型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Coyote Bioscience公司；渦旋振蕩器，美國(guó)Thermo Fisher公司；Agilent 4200 TapeStation電泳儀，美國(guó)Agilent Technology公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，美國(guó)Promega公司；NovaSeq 6000測(cè)序儀，美國(guó)Illumina公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，Axygen公司；AM10027磁力架，美國(guó)Invitrogen公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 供試藥品

BH，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)713- 9003；單甲氧基聚乙二醇-左旋聚乳酸（mPEG2000- PLLA2000），批號(hào)2019071415，相對(duì)分子質(zhì)量均為2000，購(gòu)于濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；阿斯巴甜，批號(hào)WMO327DY13，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；蔗糖，批號(hào)20081113，購(gòu)于成都科龍化工試劑廠(chǎng)；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，Milli-Q級(jí)別。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（川）2018-19。實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF潔凈級(jí)屏障系統(tǒng)，室溫20～22 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h明暗交替照明。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)物自由飲水、飲食，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2014-0008，實(shí)驗(yàn)遵循成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取BH 0.13 g，精密稱(chēng)定，各4份，分別加入100 mL超純水超聲溶解。按照前期試驗(yàn)結(jié)果[10]及甜味劑常用劑量，其中3份分別加入0.16% mPEG 2000-PLLA2000、20%蔗糖、0.6%阿斯巴甜，即得供試品溶液。

2.2 分組及樣品采集

SPF級(jí)KM雄性小鼠30只，分為5組，每組6只。按體質(zhì)量隨機(jī)分為BH組、BH＋共聚物組、 BH＋蔗糖組、BH＋阿斯巴甜組、對(duì)照組。SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)后，ig給藥，ig容量0.02 mL/g，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥后各組小鼠禁食不禁水，無(wú)菌條件下采集小鼠新鮮糞便3～5粒，立即放入滅菌后的離心管中，超低溫保存，以備腸道菌群分析[13]。

2.3 基因組DNA抽提、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

樣品微生物多樣性測(cè)序由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成。利用DNA提取試劑盒提取大鼠糞便的基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S核糖體RNA基因的V3～V4可變區(qū)。采用338F 5’-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3’，806R 5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’為引物，TransStart Fastpfu DNA Polymerase為擴(kuò)增酶，在20 μL反應(yīng)體系（5×FastPfu Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，F(xiàn)orward Primer (5 μmol/L) 1 μL，Reverse Primer (5 μmol/L) 1 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.5 μL，BSA 0.25 μL，Template DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL）中進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。隨后構(gòu)建Illumina PE250文庫(kù)，上機(jī)測(cè)序。

根據(jù)overlap關(guān)系，將Illumina PE250測(cè)序得到的PE reads進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和濾過(guò)，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU（operational taxonomic units）聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析，相似度為97%。

2.4 菌群的多樣性分析

利用OTU聚類(lèi)結(jié)果與R語(yǔ)言工具繪制稀釋曲線(xiàn)、Shannon-Wiener曲線(xiàn)、Rank-Abundance曲線(xiàn)與Specaccum物種累積曲線(xiàn)以檢測(cè)測(cè)序深度。其中，隨著測(cè)序量的增加，稀釋曲線(xiàn)的平緩程度反映測(cè)序深度對(duì)樣品中物種的覆蓋度。Shannon-Wiener曲線(xiàn)是反映各樣本在不同測(cè)序量時(shí)的微生物多樣性。Rank-Abundance曲線(xiàn)表明，樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度呈現(xiàn)于曲線(xiàn)在橫軸上的長(zhǎng)度，曲線(xiàn)越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度呈現(xiàn)于曲線(xiàn)的形狀，曲線(xiàn)越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。Specaccum物種累積曲線(xiàn)可以判斷樣本量是否充分，并可以預(yù)測(cè)樣品的物種豐富度。曲線(xiàn)趨于平緩，表示在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多，抽樣充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行α多樣性分析，按照0.97的相似性閾值將序列劃分為一個(gè)物種，比較試驗(yàn)組間OTU、Ace、Chao、Coverage、Shannon、Simpson指數(shù)的差異。OTU表示在樣品中微生物物種的數(shù)量；Ace與Chao指數(shù)是對(duì)菌群物種的總數(shù)評(píng)估；Shannon指數(shù)主要用來(lái)估算樣本中微生物多樣性，Shannon越大，說(shuō)明群落多樣性越高。Simpson指數(shù)描述從一個(gè)群落種連續(xù)兩次抽樣所得到的個(gè)體數(shù)屬于同一種的概率，Simpson越大，即種類(lèi)越均一。

2.5 β多樣性分析

樣本間的物種或功能的豐度分布差異程度可通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)中的距離進(jìn)行量化分析，使用統(tǒng)計(jì)算法Bray-Curtis計(jì)算兩兩樣本間距離，通過(guò)距離矩陣比較不同樣本間物種差異，即β多樣性分析，包括主成分分析（principal components analysis，PCA）、主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）、非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）。

2.6 物種組成與差異菌群分析

基于分類(lèi)學(xué)信息，對(duì)各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。采用Usearch軟件和Gold數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Donovo和Reference結(jié)合的方式去除嵌合體，Silva（SSU115）16S細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)比對(duì)。采用LEfSE分析，找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種。

3 結(jié)果

3.1 菌群的多樣性分析

利用OTU聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序深度的檢測(cè)與α多樣性分析，如圖1所示，30個(gè)樣本的稀釋曲線(xiàn)均趨于平緩，且大部分樣品達(dá)到平臺(tái)期，可以認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。Shannon-Wiener曲線(xiàn)均趨向平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。Rank-Abundance樣本曲線(xiàn)的延伸終點(diǎn)的OTU值均大于200，物種數(shù)量較多，且曲線(xiàn)均平滑下降，表明樣本的物種多樣性較高。Specaccum物種累積曲線(xiàn)趨于平緩，表示在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多，抽樣充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間OTU、Ace、Chao、Coverage、Shannon、Simpson差異均不顯著，結(jié)果見(jiàn)表1。相比于BH組，BH＋阿斯巴甜組、BH＋共聚物組、BH＋蔗糖組的OTU數(shù)量、Ace與Chao指數(shù)均有增大的趨勢(shì)，且3種多樣性評(píng)價(jià)指標(biāo)變化趨勢(shì)相同。增大趨勢(shì)最明顯的是BH＋阿斯巴甜組，其次是BH＋共聚物組，表明BH溶液經(jīng)過(guò)蔗糖、共聚物、阿斯巴甜掩味后，其物種總數(shù)有升高的趨勢(shì)。相比于BH組，BH＋共聚物組的菌群Shannon指數(shù)最為接近，即2組間菌群多樣性基本不變，BH＋蔗糖組菌群多樣性有升高的趨勢(shì)，BH＋阿斯巴甜組有降低的趨勢(shì)。因此，甜味劑可能會(huì)影響腸道菌群的多樣性，而經(jīng)共聚物掩味后，不影響腸道菌群的多樣性。

A-稀釋曲線(xiàn) B-Shannon-Wiener曲線(xiàn) C-Rank-Abundance曲線(xiàn) D-Specaccum物種累積曲線(xiàn) 1-BH組 2-BH＋共聚物組 3-BH＋蔗糖組 4-BH＋阿斯巴甜組 5-對(duì)照組

表1 各組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)(, n = 6)

3.2 β多樣性分析

通過(guò)β多樣性分析比較樣本間的物種或功能的豐度分布差異程度，如圖2-A所示，各組樣品間組內(nèi)差異與組間差異均較大。其中，各組間組內(nèi)差異程度幾乎一致，與BH組比較，對(duì)照組群落構(gòu)成差異最大，與其余組之間的差異不大；與BH＋共聚物組相比，BH＋蔗糖與對(duì)照組群落構(gòu)成差異最大；與對(duì)照組比較，BH組與BH＋阿斯巴甜組群落構(gòu)成差異最大。PCA、PCoA與NMDS結(jié)果顯示，與BH組相比，BH＋共聚物組群落構(gòu)成最接近，其次是BH＋阿斯巴甜組；與對(duì)照組比較，BH組群落構(gòu)成差異最大，其次是BH＋共聚物組與BH＋阿斯巴甜組（圖2-B～D）。樣品間的群落構(gòu)成無(wú)論是組內(nèi)差異還是組間差異均具有明顯的差異，可能是由于微生物的群落構(gòu)成存在著很大的個(gè)體差異。BH組與BH＋共聚物組微生物的群落構(gòu)成最接近，且與對(duì)照組群落構(gòu)成存在明顯差異，表明BH與BH＋共聚物組具有明顯的抑菌藥效，且共聚物不影響B(tài)H的抑菌藥效。BH＋蔗糖組微生物的群落構(gòu)成最接近于正常腸道微生物群落構(gòu)成，可能是由于利用蔗糖對(duì)藥物進(jìn)行矯味后，可引起腸道的細(xì)菌數(shù)與淀粉酶活性降低，大腸桿菌數(shù)與蛋白酶活性升高[14]，從而降低BH抑菌藥效。

3.3 物種組成分析

樣品各分類(lèi)水平中的物種Profiling柱狀圖見(jiàn)圖3。在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，BH組與BH＋共聚物組中變形菌門(mén)占比較其余3組小， BH＋阿斯巴甜組中放線(xiàn)菌門(mén)占比較其余4組小。在屬水平上，擬桿菌目$24-7組（Bacteroidales S24-7 group_ norank）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；BH組與BH＋共聚物組中擬桿菌屬、毛螺菌科Lachnospira、腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌種；BH＋蔗糖、 BH＋阿斯巴甜組與對(duì)照組螺桿菌屬占比明顯升高。因此，變形菌門(mén)數(shù)量增多、放線(xiàn)菌門(mén)數(shù)量減小與螺桿菌屬升高很可能是甜味劑導(dǎo)致腸道菌群多樣性升高的原因。

A-組間組內(nèi)距離箱式圖 B-PCA圖 C-PCoA圖 D-NMDS分析圖 1-BH組 2-BH＋共聚物組 3-BH＋蔗糖組 4-BH＋阿斯巴甜組 5-對(duì)照組

A-按門(mén)劃分的微生物群落柱狀圖 B-按屬劃分的微生物群落柱狀圖 1-BH組 2-BH＋共聚物組 3-BH＋蔗糖組 4-BH＋阿斯巴甜組 5-對(duì)照組

3.4 差異菌群分析

采用LEfSE分析，統(tǒng)計(jì)對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種，結(jié)果見(jiàn)圖4。BH組有4個(gè)顯著差異菌群，分別是戈登氏桿菌屬、布勞特氏菌屬、瘤胃球菌科NK4A214群（Ruminococcaceae NK4A214 group）、。BH＋共聚物組有4個(gè)顯著差異菌群，分別為擬桿菌目（Bacteroidales）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、Tyzzerella 3。BH＋蔗糖組有6個(gè)顯著差異菌群，分別為嗜木聚糖真桿菌屬（[Eubacterium] xylanophilum group）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、紅螺菌科（Rhodospirillaceae）、未培養(yǎng)的紅螺菌科（Rhodospirillaceae uncultured）、變形菌綱（Alphaproteobacteria）、理研菌科-RC9（Rikenellaceae RC9 gut group）。BH＋阿斯巴甜組有2個(gè)顯著差異菌群，分別為理研菌科（Rikenellaceae）、另枝菌屬。對(duì)照組有5個(gè)顯著差異菌群，分別為瘤胃球菌科UCG-013（Ruminococcaceae UCG- 013）、未培養(yǎng)的紅蝽?xiàng)U菌科（Coriobacteriaceae uncultured）、擬桿菌目$24-7組、未培養(yǎng)的擬桿菌目（Bacteroidales uncultured）以及屬。

A-進(jìn)化分枝圖: 紅色區(qū)域和綠色區(qū)域表示不同分組，紅色節(jié)點(diǎn)表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類(lèi)群，綠色節(jié)點(diǎn)表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類(lèi)群，黃色節(jié)點(diǎn)表示的是在兩組中均沒(méi)有起到重要作用的微生物類(lèi)群 B-LDA分析柱狀圖: 1-BH組，2-BH＋共聚物組，3-BH＋蔗糖組，4-BH＋阿斯巴甜組，5-對(duì)照組

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同矯味劑對(duì)差異菌群的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。在BH組4個(gè)顯著差異菌群中，戈登氏桿菌屬、布勞特氏菌屬、瘤胃球菌科NK4A214群以及屬相對(duì)豐度最高，且瘤胃球菌科NK4A214群僅在BH組檢測(cè)出。在BH＋共聚物組的4個(gè)顯著差異菌群中，擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，且Tyzzerella 3僅在BH＋共聚物組中檢測(cè)出。在BH＋蔗糖組的5個(gè)顯著差異菌群中，嗜木聚糖真桿菌的相對(duì)豐度最高，與其余組均具有顯著性差異。理研菌科-RC9在BH組與BH＋共聚物組的相對(duì)豐度具有顯著降低。在BH＋阿斯巴甜組的2個(gè)顯著差異菌群中，相比于BH組，理研菌科、另枝菌屬在BH＋蔗糖組、BH＋阿斯巴甜組與對(duì)照組的相對(duì)豐度顯著高于BH組，BH組與BH＋共聚物組沒(méi)有顯著差異。在對(duì)照組的5個(gè)顯著差異菌群中，瘤胃球菌科UCG-013、未培養(yǎng)的紅蝽?xiàng)U菌科、未培養(yǎng)的擬桿菌目、Tyzzerella菌群豐度最高，而擬桿菌目$24-7組在BH＋共聚物組中豐度最高。

表2 小鼠腸道菌群的相對(duì)豐度

與BH組比較：*＜0.05；與BH＋共聚物組比較：Δ＜0.05；與BH＋蔗糖組比較：&＜0.05；對(duì)照組比較：#＜0.05

*< 0.05BH group;Δ< 0.05BH+ copolymers group;&< 0.05BH+ sucrose group;#< 0.05blank control group

4 討論

通過(guò)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，BH經(jīng)過(guò)蔗糖、mPEG 2000-PLLA2000、阿斯巴甜掩味后，其物種總數(shù)有升高的趨勢(shì)。共聚物不影響B(tài)H菌群的多樣性，蔗糖具有使BH菌群多樣性升高的趨勢(shì)，阿斯巴甜具有使BH菌群多樣性降低的趨勢(shì)。因此，甜味劑可能會(huì)影響腸道菌群的多樣性。BH組與BH＋共聚物組微生物的群落構(gòu)成最接近，且與對(duì)照組群落構(gòu)成存在明顯差異，表明共聚物不影響B(tài)H的抑菌藥效。加入甜味劑掩味后，變形菌門(mén)數(shù)量增多、放線(xiàn)菌門(mén)數(shù)量減小、與螺桿菌屬升高可能引起腸道菌群多樣性升高。

雖然瘤胃球菌科NK4A214群僅在BH組檢測(cè)出，Tyzzerella-3僅在BH＋共聚物組中檢測(cè)出，但其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其余顯著差異菌群，體內(nèi)活性未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。在人類(lèi)中，神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺在胃腸道中濃度最高，其參與胃腸分泌、運(yùn)動(dòng)和疼痛感知的調(diào)節(jié)。5-羥色胺的含量升高，可引起炎癥性疼痛，而據(jù)以往研究報(bào)道，另枝菌屬可能是產(chǎn)生5-羥色胺的菌群[15]。BH＋阿斯巴甜組可引起腸道菌群中另枝菌屬豐度的升高，增加疼痛的感知。因此，阿斯巴甜有可能降低BH的鎮(zhèn)痛藥效。另外，理研菌科的豐度與血清瘦素水平呈正相關(guān)，血清瘦素參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)，可促使機(jī)體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細(xì)胞的合成。其相對(duì)豐度的升高與強(qiáng)制性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病還存在有明顯的相關(guān)性[16]。因此，阿斯巴甜與蔗糖可能會(huì)引起理研菌科相對(duì)豐度升高，而影響糖、脂肪及能量代謝，或引起免疫系統(tǒng)的紊亂。有研究表明，嗜木聚糖真桿菌的增多與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生可能存在正相關(guān)，大量長(zhǎng)期服用蔗糖存在發(fā)生小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)[17]。因此，經(jīng)甜味劑掩蔽BH苦味后，長(zhǎng)期使用可能會(huì)導(dǎo)致BH的鎮(zhèn)痛藥效降低，引起體內(nèi)代謝紊亂，應(yīng)盡量避免長(zhǎng)期大劑量使用。兩親性嵌段共聚物不會(huì)對(duì)BH腸道菌群造成顯著影響，進(jìn)一步證明了其臨床實(shí)用價(jià)值。

開(kāi)發(fā)兒童用中藥湯劑伴侶劑，顯著抑制湯劑苦味、改善湯劑口感，是中醫(yī)兒科臨床與醫(yī)院藥學(xué)的期盼，對(duì)于提高兒童服藥順應(yīng)性、提升中醫(yī)藥在我國(guó)衛(wèi)生健康領(lǐng)域的服務(wù)能力具有重要意義[18]。本研究證明了兩親性嵌段共聚物的安全性，尤其是長(zhǎng)期服藥條件下幾乎不干擾藥物對(duì)腸道菌群的作用。這為以?xún)捎H性嵌段共聚物為主要輔料，開(kāi)發(fā)兒童用中藥湯劑伴侶劑奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on suitability of amphiphilic block copolymer for bitterness inhibition of traditional Chinese medicine decoction based on intestinal flora

LIN Jun-zhi1, LI Pan2, QIU Min3, KE Xiu-mei4, HAN Li3, YANG Ming5, WU Zhen-feng5, ZHANG Ding-kun3

1. Central Laboratory, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, China 2. Chengdu Qingbaijiang District People’s Hospital, Chengdu 610300, China 3. Pharmacy School, State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 4. College of Traditional Chinese Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 5. Key Lab of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To evaluate the suitability and safety of amphiphilic block copolymers for bitter suppression of traditional Chinese medicine decoction based on intestinal flora.Berberine hydrochloride (BH) with strong bitterness was used as model drug, the effects of amphiphilic block copolymer, natural sweetener (sucrose) and artificial sweetener (aspartame) on intestinal microflora of rats were compared after 2 weeks of continuous administration by high throughput sequencing technology.After being masked by amphiphilic block copolymers, sucrose and aspartame, the total number of species of BH was increased. The results showed that amphiphilic block copolymers did not affect the diversity and community composition of BH. Sucrose had a tendency to increase the diversity of BH flora, while aspartame had a tendency to decrease it.Amphiphilic block copolymers do not interfere with the effect of the drug on intestinal flora in long-term medication, so it is a safe taste masking agent for children.

traditional Chinese medicine decoction; bitter-masking; amphiphilic block copolymer; intestinal flora; development of decoction companion; berberine

R283.6

A

0253 - 2670(2021)01 - 0065 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.009

2020-08-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81803745）；四川省科技廳青年杰出科技人才資助項(xiàng)目（2019JDJQ0007）；2019-2021年度中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年人才托舉工程項(xiàng)目（2019-QNRC2-B05）；江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（TCM-201904）

林俊芝，女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)與分子生物學(xué)研究。E-mail: 582097013@qq.com

張定堃，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┡c品質(zhì)評(píng)價(jià)新技術(shù)。E-mail: zhangdingkun@cdutcm.edu.cn

伍振峰，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)/中藥制藥裝備研究。E-mail: zfwu57@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]