綠原酸對(duì)香煙煙霧提取物損傷的16HBE細(xì)胞修復(fù)作用研究

任理，王德勤

(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現(xiàn)代中藥研究院，廣東 廣州 510515)

氣道與外界相通，是呼吸系統(tǒng)的第一道防線，容易直接接觸吸入性致病因素。當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，吸入的有害物質(zhì)如粉塵顆粒、病原體等會(huì)引起氣道上皮損傷，從而引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病。氣道上皮受損后機(jī)體啟動(dòng)修復(fù)過程，以維持完整的屏障，緩解疾病。綠原酸是一種苯丙素類化合物，是山銀花、金銀花、杜仲等藥材的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂和抗腫瘤等生物活性[1]。綠原酸還具有保護(hù)細(xì)胞的作用。文獻(xiàn)報(bào)道綠原酸對(duì)香煙煙霧引起的HEK293 細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，能提高細(xì)胞存活率[2]，還能減輕PM2.5引起的CHO細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。目前綠原酸對(duì)氣道上皮損傷的修復(fù)作用研究較少，但其具有的抗炎、抗氧化、保護(hù)細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)等作用與損傷修復(fù)密切相關(guān)[4]?；诖?，本研究以人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE細(xì)胞)為載體，體外模擬氣道上皮損傷，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及相關(guān)因子的表達(dá)，探討綠原酸對(duì)氣道上皮受損后的修復(fù)作用。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

綠原酸(廣州昂飛生物科技股份有限公司，批號(hào)150801);潑尼松(MEDChem Express公司，批號(hào)HY-B0214);RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(gibco);EGF、TGF-β1、IL-10、TNF-α、IL-6試劑盒(深圳中生穗豐);SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(上海貝博生物科技有限公司);彩色預(yù)染低分子蛋白marker(Thermo Fisher);ERK1+ERK2多克隆抗體(Abcam);羊抗兔IgG(Earthox);香煙(黃金葉)。

1.2 細(xì)胞株

16HBE細(xì)胞來自廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸病理研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要儀器

HH.CP-01 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek Instruments Inc.)；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)(廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司)。

2 方法

2.1 制備香煙煙霧提取物

具體方法參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道，取10 mL RPMI-1640培養(yǎng)基置于抽濾瓶，抽濾瓶連接長(zhǎng)頸漏斗，香煙放于長(zhǎng)頸漏斗上，點(diǎn)燃后開始抽濾，生成的煙霧溶于培養(yǎng)基中，0.22 μm微孔濾膜過濾后作為CSE原液(100%)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用無血清培養(yǎng)基稀釋至濃度為1.2%。

2.2 綠原酸細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、綠原酸不同劑量組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，用含有10%(φ)的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)基，給藥組給予綠原酸(終質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL)，24 h后加入MTT試劑處理4 h，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度A，波長(zhǎng)490 nm，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率=(A給藥組/A空白對(duì)照組)×100%。

2.3 綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞損傷的修復(fù)作用

2.3.1 綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 根據(jù)“2.2”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定綠原酸濃度。實(shí)驗(yàn)分為模型組、陽性對(duì)照組(潑尼松，質(zhì)量濃度為5 μg/mL)、綠原酸各劑量組。給藥組細(xì)胞分別給予不同濃度的綠原酸，模型組加入等量無血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，再用CSE刺激24 h，于顯微鏡下觀察16HBE細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，加入MTT試劑處理，測(cè)定各給藥組細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)率。相對(duì)生長(zhǎng)率=(A給藥組/A模型組)×100%。

2.3.2 綠原酸對(duì)細(xì)胞因子含量的影響 在“2.3.1”的基礎(chǔ)上增加空白對(duì)照組，按照“2.3.1”項(xiàng)的方式處理細(xì)胞，24 h后取細(xì)胞上清液，用ELISA法檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量。

2.3.3 綠原酸對(duì)ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響 采用Western blot法檢測(cè)16HBE細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)蛋白的表達(dá)。取細(xì)胞樣品，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)上清液中蛋白濃度，確定蛋白上樣量。樣品與上樣緩沖液混合后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加5%脫脂奶粉封閉，于室溫下加入一抗孵育2 h，洗膜3次，加二抗孵育2 h，洗膜3次，用ECL顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照，進(jìn)行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞的毒性作用

不同濃度綠原酸作用于16HBE細(xì)胞，除6.25 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率略低于空白對(duì)照組，其余濃度下細(xì)胞存活率均高于空白對(duì)照組，說明在6.25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖1。

1.空白對(duì)照組； 2.綠原酸6.25 μg/mL組； 3.綠原酸12.5 μg/mL組； 4.綠原酸25 μg/mL組； 5.綠原酸50 μg/mL組； 6.綠原酸100 μg/mL組； 7.綠原酸200 μg/mL組。與空白對(duì)照組比較：#P<0.05。

3.2 綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

給予不同濃度的綠原酸(終質(zhì)量濃度分別為200、100、50 μg/mL)，觀察CSE刺激造模的16HBE細(xì)胞的狀態(tài)，結(jié)果如圖2所示。在光學(xué)倒置顯微鏡下，空白對(duì)照組16HBE細(xì)胞貼壁良好，呈不規(guī)則多邊形，生長(zhǎng)均勻、致密，邊界清晰；模型組細(xì)胞部分皺縮變圓，細(xì)胞間間隙部分模糊；給藥組細(xì)胞形態(tài)程度不同地接近于正常組細(xì)胞。

3.3 綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如表1所示，不同濃度的綠原酸(終濃度分別為200、100、50 μg/mL)作用于16HBE細(xì)胞，經(jīng)1.2% CSE刺激24 h后，相比模型組，給藥組細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率有上升趨勢(shì)，其中高、中劑量組細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明綠原酸能促進(jìn)CSE刺激后16HBE細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

表1 綠原酸對(duì)16HBE細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3.4 綠原酸對(duì)EGF、TGF-β1含量的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，相比空白對(duì)照組，CSE刺激導(dǎo)致模型組EGF、TGF-β1含量均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。不同濃度的綠原酸均能顯著提高16HBE細(xì)胞中EGF含量(P<0.01，P<0.05)，各給藥組細(xì)胞中TGF-β1含量也有所升高，以高劑量組TGF-β1含量提高最明顯(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 綠原酸對(duì)EGF、TGF-β1含量的影響

3.5 綠原酸對(duì)TNF-α、IL-6、IL-10含量的影響

如表3所示，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，CSE影響了16HBE細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，使TNF-α、IL-6含量升高(P<0.01)，IL-10含量降低(P<0.05)。不同濃度的綠原酸處理16HBE細(xì)胞，可以上調(diào)細(xì)胞上清液中IL-10的水平，下調(diào)TNF-α、IL-6的水平，表明綠原酸具有較好的抗炎作用。

表3 綠原酸對(duì)TNF-α、IL-6、IL-10含量的影響

3.6 綠原酸對(duì)ERK1/2表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中ERK1/2表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不同濃度的綠原酸均能上調(diào)16HBE細(xì)胞中ERK1/2的表達(dá)水平，且呈劑量相關(guān)性。結(jié)果如圖3所示。

1.空白對(duì)照組; 2.模型組; 3.陽性對(duì)照組; 4.綠原酸高劑量組; 5.綠原酸中劑量組; 6.綠原酸低劑量組。與空白對(duì)照組比較：**P<0.01; 與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

氣道上皮是呼吸系統(tǒng)抵御外界有害刺激的屏障，容易受到各種致病因素(生物、化學(xué)、物理等)的刺激出現(xiàn)損傷。氣道上皮受損后機(jī)體啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，使上皮結(jié)構(gòu)保持完整，恢復(fù)屏障功能。氣道上皮的損傷修復(fù)涉及上皮細(xì)胞的分裂增生和分化，多種細(xì)胞因子、趨化因子和炎癥介質(zhì)的釋放，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)和調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的過程[6]。

作為天然產(chǎn)物領(lǐng)域的熱點(diǎn)，綠原酸的生物活性得到深入研究，包括心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面[7]。但臨床上綠原酸極少以單體物質(zhì)的形式出現(xiàn)，更常見的是含有綠原酸及其衍生物的中藥作為復(fù)方制劑的原料藥材，與其他中藥配伍使用，綠原酸是該復(fù)方制劑的主要活性成分之一。如臨床常用中成藥口炎清顆粒，組方以山銀花和其他藥材配伍。文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用UFLC-Q-TOF-MS/MS(超快速高效液相色譜儀與四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀串聯(lián))圖譜與藥效相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了口炎清顆粒發(fā)揮抗炎藥效的活性成分群，包括綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、麥冬皂苷、甘草苷、異槲皮苷等[8]。報(bào)道指出綠原酸還能有效抑制反式二氫二醇環(huán)氧苯并[a]芘(benzo[a]pyrene-7，8-diol-9，10-epoxide，BPDE)造成的16HBE細(xì)胞損傷，減少16HBE細(xì)胞凋亡，降低胞內(nèi)氧自由基(ROS)的水平[9]，說明綠原酸能保護(hù)氣道細(xì)胞免受環(huán)境中有害因素引起的損傷。

CSE從香煙煙霧中提取，含有尼古丁、焦油等大量有害物質(zhì)，能直接損傷氣道上皮。本研究以CSE刺激16HBE細(xì)胞，體外模擬氣道上皮損傷。不同濃度的綠原酸作用于細(xì)胞后，與模型組相比，給藥組細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率有所上升，說明綠原酸能促進(jìn)CSE刺激下16HBE細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

生長(zhǎng)因子能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與其他細(xì)胞功能，其表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與釋放等[10]。EGF可以趨化表皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其向受損部位移動(dòng)及分裂增生。TGF-β1有促進(jìn)上皮細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向創(chuàng)傷部位遷移，刺激細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用[11]。本研究以CSE刺激16HBE細(xì)胞造模，不同濃度的綠原酸均顯著提高細(xì)胞中EGF、TGF-β1含量，表明綠原酸通過影響EGF、TGF-β1的表達(dá)，調(diào)節(jié)16HBE細(xì)胞增殖，參與損傷修復(fù)。

損傷修復(fù)過程始終伴隨炎癥反應(yīng)，本研究以炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10作為觀察指標(biāo)，判斷炎癥反應(yīng)的程度。TNF-α屬于免疫防護(hù)介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中與其他細(xì)胞因子和趨化因子一起啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種炎癥因子，并維持炎癥反應(yīng)[12]。IL-6由免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)分泌，起到促進(jìn)炎癥的作用[13]。IL-10也稱細(xì)胞因子合成抑制因子，其產(chǎn)生通常與炎癥的消除有關(guān)，能抑制和終止炎癥反應(yīng)[14]。實(shí)驗(yàn)中CSE刺激導(dǎo)致16HBE細(xì)胞中TNF-α、IL-6含量明顯升高，IL-10含量明顯降低，說明CSE引起了細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。綠原酸能上調(diào)IL-10的表達(dá)，下調(diào)TNF-α、IL-6的表達(dá)，表明綠原酸有較好的抗炎作用，可抑制炎癥反應(yīng)。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。ERK1/2通路是MAPK通路的一部分，主要介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化等過程[15-16]，還與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，能介導(dǎo)應(yīng)激刺激、炎癥介質(zhì)等引起的細(xì)胞反應(yīng)[17]。研究中綠原酸能顯著上調(diào)16HBE細(xì)胞中ERK1/2蛋白的表達(dá)，說明綠原酸可通過ERK1/2通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制炎癥的作用，從而加速損傷修復(fù)。

綜上所述，綠原酸有促進(jìn)16HBE細(xì)胞損傷修復(fù)的作用，介導(dǎo)ERK1/2蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子水平，抑制炎癥反應(yīng)可能是其發(fā)揮作用的原因。