中藥復(fù)方DC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的體內(nèi)外抗菌作用研究

董碧蓮，蔡延渠，2，3，朱志東，朱盛山,朱宇嘉

(1.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心, 廣東 廣州 510006； 2.廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑實(shí)驗(yàn)室(三級(jí))，廣東 廣州 510006； 4.廣州普精生物有限公司，廣東 廣州 510663)

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli) 又稱大腸埃希菌，為一類有周身鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無芽孢的革蘭陰性短桿菌，主要寄居在人體的大腸內(nèi)，是醫(yī)院感染主要的條件致病菌之一，可導(dǎo)致腹瀉、腹膜炎、膀胱炎及膽囊炎等，十分常見與流行，對(duì)人類健康造成了較大威脅[1-3]。耐藥菌是指具有耐藥性的病原菌，其耐藥性是因細(xì)菌多次與藥物接觸后，對(duì)藥物的敏感性減小甚至消失而使藥物對(duì)耐藥菌的療效降低甚至是無效[4]。近年來，大腸桿菌感染率的逐漸上升及耐藥性日趨嚴(yán)重，目前報(bào)道最多的是引起霍亂樣腹瀉的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶(產(chǎn)ESBLs)大腸桿菌，其中產(chǎn)ESBLs大腸桿菌WHO在2017年發(fā)表的“十二惡菌”列表中被列為“極為重要”耐藥菌。

鑒于細(xì)菌耐藥性的嚴(yán)重化程度繼續(xù)加深，世界衛(wèi)生組織極力呼吁研發(fā)新抗生素以改善這一現(xiàn)狀。相關(guān)研究表明[5-6]，天然來源的中草藥不僅具有較強(qiáng)的抗產(chǎn)ESBLs大腸桿菌作用，還具備不易產(chǎn)生耐藥、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。中藥復(fù)方DC是由草烏葉、三七花、黃芩等組成，民間常用于治療腹瀉等癥，療效明顯，但目前尚無任何相關(guān)性研究報(bào)道。本研究擬通過體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)性評(píng)價(jià)中藥復(fù)方DC的抗菌、抗炎作用，以期為中藥復(fù)方DC的更進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

CAMHB肉湯，海博生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：20180412)；M-H瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司(批號(hào)：1081661)；氨芐西林10 μg/片，杭州微生物試劑有限公司(批號(hào)：20180809)；阿莫西林20 μg/片，杭州微生物試劑有限公司(批號(hào)：20180702)；氨芐青霉素鈉，上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)：S18O8Y45712)；阿莫西林，上海源葉生物科技有限公司(批號(hào)：S06N8Y47124)；克拉維酸，大連美侖生物科技有限公司(批號(hào)：F0204AS)；亞胺培南，大連美侖生物科技有限公司(批號(hào)：A0401A)；干擾素-γ測(cè)定ELISA試劑盒，北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：SEKH0046)；細(xì)胞白介素-6測(cè)定ELISA試劑盒(批號(hào)：SEKH0052)。

1.2 中藥復(fù)方DC

中藥復(fù)方DC由草烏葉、三七花、黃芩等組成，以10倍體積量的50%(φ)乙醇加熱回流提取2次，1 h/次，3 500 r/min離心10 min，取上清液濃縮至含生藥量為1 g/mL的浸膏溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種健康小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-002。

1.4 實(shí)驗(yàn)菌株

大腸桿菌(編號(hào)ATCC25922，由廣東省微生物研究所提供)；大腸桿菌(編號(hào)GZM1.457，臨床分離耐藥菌株，由廣東省微生物研究所提供)。

1.5 劑量設(shè)計(jì)

人(70 kg)與小鼠(20 g)的表面積折算系數(shù)為0.002 6，假設(shè)人的臨床用藥劑量為A g/kg，則小鼠與人的等效劑量=A g/kg×70 kg×0.002 6/20 g=9.1A g/kg，即小鼠與人的等效劑量為人用藥劑量的9.1倍。

中藥復(fù)方DC臨床用量9 g/d，成人體重以70 kg計(jì)，平均用藥劑量為0.13 g/(kg·d)。本實(shí)驗(yàn)中藥復(fù)方DC的小鼠劑量設(shè)置為高(2.340 g/kg)、中(1.170 g/kg)、低(0.585 g/kg)3個(gè)劑量組，上述劑量分別為小鼠臨床等效用藥劑量的2、1、0.5倍。

氨芐西林臨床用量為0.5 g/70 kg(人)，平均用藥劑量為0.007 g/kg，小鼠用藥劑量為人等效劑量0.065 g/kg。亞胺培南臨床用量為1 g/70 kg，小鼠用藥劑量為人等效劑量0.014 g/kg。

2 方法

2.1 試驗(yàn)菌株的抗生素藥敏試驗(yàn)

按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)頒布的2017版抗生素敏感實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床分離的大腸桿菌進(jìn)行抗生素的敏感性、耐藥性測(cè)定。

2.2 體外抗菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 中藥復(fù)方DC抑菌圈測(cè)定 將冷藏保存的菌種在瓊脂板上劃線，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，刮取生長(zhǎng)良好的菌落配制成1×106CFU/mL菌懸液。吸取0.1 mL菌懸液于瓊脂板涂勻，將藥敏片貼放于含菌的瓊脂平板表面，各紙片間距離相等，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2.2.2 中藥復(fù)方DC最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 按無菌操作將藥物2倍稀釋，吸取藥液和菌液各0.1 mL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌液各100 μL作為陰性對(duì)照，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果，藥物最低濃度孔無細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為MIC值。

2.3 體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 小鼠最低致死量(MLD)的測(cè)定 將受試菌劃線于瓊脂培養(yǎng)皿培養(yǎng)后，取菌苔制成菌懸液，大腸桿菌配制為9×107、9×108、9×109CFU/mL濃度，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌配制為2×107、2×108、2×109CFU/mL濃度，5%酵母液配制菌懸液。取昆明小鼠60只，體質(zhì)量18 ～ 22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組10只，將不同濃度的菌懸液分別進(jìn)行小鼠腹腔注射，每只注射量0.5 mL/20 g，觀察2 d內(nèi)的死亡情況，以死亡率達(dá)80%～100%的菌液濃度為MLD。

2.3.2 中藥復(fù)方DC體內(nèi)抗大腸桿菌實(shí)驗(yàn) 取昆明小鼠208只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為13組，每組16只，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料喂食，自由攝食飲水，于正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。大腸桿菌分別設(shè)置空白組、模型組、DC低、中、高劑量組、對(duì)照藥氨芐西林組；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌設(shè)置空白組、模型組、DC低、中、高劑量組、陰性對(duì)照藥氨芐西林、陽性對(duì)照組亞胺培南。各組動(dòng)物按照“1.5”項(xiàng)下相應(yīng)給藥劑量進(jìn)行給藥，1次/天，在第2天給藥1 h后用MLD濃度的菌液腹腔注射進(jìn)行感染，于感染后4 h再給藥1次，之后每天給藥1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；觀察小鼠進(jìn)食、體表、行為活動(dòng)等情況，統(tǒng)計(jì)、記錄5 d后小鼠的死亡數(shù)量。

2.4 白細(xì)胞介素-6(IL-6)的測(cè)定

2.4.1 IL-6的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前取出試劑盒室溫下回溫30 min，雙蒸水配制洗滌液備用。凍干標(biāo)準(zhǔn)品加入1 mL稀釋液待溶解完全后搖晃混勻得質(zhì)量濃度為1 000 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)2倍稀釋成質(zhì)量濃度為250、125、62.5、31.25、15.63、7.80、3.90、0 pg/mL。分別取100 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入反應(yīng)孔中，封板后于37 ℃孵育箱孵育，90 min后取出洗板4次后，加入100 μL HRP標(biāo)記過的IL-6抗體，37 ℃孵育60 min后洗滌，加入100 μL酶結(jié)合物，37 ℃孵育60 min后洗滌，再加入100 μL顯色底物37 ℃孵育15 min后加入50 μL終止液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。

2.4.2 樣品的IL-6含量測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血，室溫下血液自然凝固20 min后在4 ℃條件下3 200 r/min離心10 min，將上清液分裝于2 mL的EP管中，-75 ℃下保存?zhèn)溆谩０凑铡?.4.1”項(xiàng)下操作測(cè)定A值，代入回歸方程計(jì)算出樣品中IL-6含量。

2.5 干擾素-γ(IFN-γ)的測(cè)定

2.5.1 IFN-γ的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前30 min取出試劑盒室溫下回溫至室溫，洗滌液用雙蒸水配制備用。凍干IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品加入中1 mL稀釋液待溶解完全后得1 000 pg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，2倍稀釋成1 000、/500、250、125、62.5、31.25、15.63、0 pg/mL。分別取100 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入反應(yīng)孔中，封板后于37 ℃孵育箱孵育，90 min后取出洗板4次后，加入100 μL標(biāo)記過的IFN-γ抗體，37 ℃孵育60 min后洗滌，加入100 μL酶結(jié)合物，37 ℃孵育30 min后洗滌，再加入100 μL顯色底物37 ℃孵育15 min后加入50 μL終止液，5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。

2.5.2 樣品的IFN-γ含量測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血，室溫下血液自然凝固20 min后在4 ℃條件下3 200 r/min離心10 min，將上清液分裝于2 mL的EP管中，-75 ℃下保存?zhèn)溆?。按照?.5.1”項(xiàng)下測(cè)定操作測(cè)定A值，代入回歸方程上計(jì)算出樣品中IFN-γ含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

3 結(jié)果

3.1 大腸桿菌對(duì)抗生素的敏感性測(cè)定

表1結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦表現(xiàn)出敏感性；臨床耐藥大腸桿菌則均表現(xiàn)為耐藥，判斷為產(chǎn)ESBLs大腸桿菌。

3.2 中藥復(fù)方DC體外抗大腸桿菌的研究

通過抑菌圈直徑、MIC測(cè)定，中藥復(fù)方DC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抗菌效果等同，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抑制作用。見表2。

表1 大腸桿菌的抗生素藥敏結(jié)果

表2 中藥復(fù)方DC的體外抗菌結(jié)果

3.3 中藥復(fù)方DC對(duì)大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用

3.3.1 小鼠感染發(fā)病癥狀觀察 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得大腸桿菌、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的MLD分別為9×108、2×108CFU/mL，以此濃度感染小鼠模型組造模成功。與空白組相比，感染組小鼠精神萎靡，活動(dòng)能力降低，覓食飲水減少，各給藥組小鼠相比模型組小鼠的飲食與活動(dòng)情況均較強(qiáng)。感染小鼠萎靡衰弱，眼為干酪樣封閉，直至死亡，小鼠死亡時(shí)間集中在感染后10～24 h。死亡小鼠解剖后腹膜腔有黏液發(fā)出惡臭，大腸、肝臟起膿腫，肺部淤血等；存活小鼠在感染48 h后飲食、活動(dòng)等恢復(fù)正常。

3.3.2 藥物對(duì)小鼠體內(nèi)受試菌株的抑制作用 通過口服藥物發(fā)現(xiàn)，由表3結(jié)果可知，與標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠模型組相比，氨芐西林組小鼠死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，能有效地保護(hù)感染小鼠；中藥復(fù)方DC高、中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)，對(duì)感染小鼠起到較好的保護(hù)作用。

由表4結(jié)果可知，與產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠模型組相比，陽性抗生素亞胺培南組的小鼠死亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，能夠有效保護(hù)感染小鼠，但陰性抗生素氨芐西林組則未起到有效的抑制作用(P>0.05)，表明產(chǎn)ESBLs大腸桿菌對(duì)氨芐西林產(chǎn)生耐藥性。中藥復(fù)方DC高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可對(duì)感染小鼠起到明顯的保護(hù)作用。

表3 藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用

3.3.3 小鼠血清中IL-6的測(cè)定 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度、吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得IL-6的線性回歸方程為y=0.010 9x+0.148 5(R2=0.991)，將各實(shí)驗(yàn)組樣品A值代入方程中計(jì)算含量。

由表5結(jié)果可知，與模型組相比，氨芐西林組、復(fù)方DC高劑量與中劑量組能夠顯著降低標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠血清的IL-6含量(P<0.01或P<0.05)。由表6結(jié)果可知，與模型組相比，氨芐西林對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠血清的IL-6含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，亞胺培南組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；復(fù)方DC高劑量能夠極顯著降低IL-6含量(P<0.01)。

表4 藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠的保護(hù)作用

表5 藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠血清IL-6含量的影響

3.3.4 小鼠血清中IFN-γ的測(cè)定 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度、吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得IL-6的線性回歸方程為y=0.002 8x+0.042 9(R2=0.997)，將各實(shí)驗(yàn)組樣品A值代入方程中計(jì)算含量。

由表7結(jié)果可知，與模型組相比，氨芐西林組、復(fù)方DC高、中劑量組能夠顯著降低標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠血清的IFN-γ含量(P<0.01或P<0.05)。由表8結(jié)果可知，與模型組相比，氨芐西林對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠血清的IFN-γ含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，亞胺培南組則具有極顯著性差異(P<0.01)；復(fù)方DC高、中劑量組能夠顯著降低IFN-γ含量(P<0.01或P<0.05)。

表6 藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠血清的IL-6含量影響

表7 藥物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠血清的IFN-γ含量影響

表8 藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠血清的IFN-γ含量影響

4 討論

細(xì)菌性腸道傳染病是由腸道內(nèi)的細(xì)菌感染引起的較為頻發(fā)的傳染性疾病，常出現(xiàn)腹瀉、腹痛等癥狀，其發(fā)病機(jī)制以細(xì)菌性痢疾、傷寒、副傷寒和感染性腹瀉為主[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，(1)抗菌作用方面：在體外，中藥復(fù)方DC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑、MIC值基本相同，顯示出等效的體外抑菌作用。在體內(nèi)，中藥復(fù)方DC高劑量組、中劑量組能夠顯著降低感染小鼠的死亡率，起到有效的保護(hù)作用；由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)置中劑量為臨床正常使用劑量，故低劑量組未能在體內(nèi)起到顯著的抑制作用，表現(xiàn)出具有劑量依賴性。(2)抗炎作用方面：中藥復(fù)方DC高劑量組均能顯著降低標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠血清中IL-6含量，而中劑量組只能顯著降低標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌感染小鼠血清中IL-6含量。但是，中藥復(fù)方DC高劑量組、中劑量組則均能顯著降低標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、產(chǎn)ESBLs大腸桿菌感染小鼠血清中IFN-γ含量。結(jié)果亦顯示出，中藥復(fù)方DC的體內(nèi)抗炎作用存在劑量依賴性，而且以中劑量(即臨床正常用量)方能起到有效的抗炎作用。因此，結(jié)合以上研究結(jié)果，初步推測(cè)，臨床正常用量(中劑量9 g/70 kg)為最低有效劑量。

中藥復(fù)方DC的藥味配伍組成中，草烏葉具有消炎、清熱、解毒、止痛功效，臨床常用于泄瀉、腹痛、慢性胃炎、腸應(yīng)激綜合征、乙型肝炎、流行性腮腺炎等[8-9]；如柳占彪等[10]通過小鼠耳郭腫脹實(shí)驗(yàn)和棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，草烏葉醇提物的正丁醇和氯仿萃取物均具有抗炎作用(P<0.01或P<0.05)。三七花含有皂苷類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油類、無機(jī)類等多種成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、活血化瘀等藥理活性[11]，如袁惠南等[12]通過動(dòng)物炎癥模型發(fā)現(xiàn)三七花總皂苷能有效抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)對(duì)抗因乙酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)。黃芩是傳統(tǒng)清熱中藥，含有黃酮類、苯丙素類、甾類化合物、揮發(fā)油等多種成分，能夠發(fā)揮抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保肝、增強(qiáng)免疫、抗心律失常等作用[13]；如戴碧鑫等[13]發(fā)現(xiàn)黃芩及其藥渣均對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等具有明顯的體外抑制作用，張倩等[14]通過ELISA法發(fā)現(xiàn)，黃芩素能顯著抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放。

綜上所述，中藥復(fù)方DC具有良好的體內(nèi)外抗菌、抗炎作用，值得在抗大腸桿菌及產(chǎn)ESBLs大腸桿菌方面進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，為其作為替抗新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。