龍虎人丹改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞肥大的作用研究

王剛，程偉，于澤，丁禮琴，金家驊，金桂芳

(1.江西省高安市中醫(yī)院，江西 高安 330800； 2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006； 3.上海中華藥業(yè)有限公司，上海 201707)

肥胖是一種臨床常見的慢性代謝性疾病，肥胖常伴隨或并發(fā)糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝、高脂血癥和心腦血管等疾病，還會增加腫瘤的發(fā)病率[1]。由于高熱量飲食的大量攝入以及久坐不動的生活方式，目前，全球范圍內(nèi)約有1.077億兒童和6.037億成人發(fā)展為肥胖人群，肥胖總體患病率分別為5%和12%[2-4]。如何減肥也日益成為我國衛(wèi)生健康領(lǐng)域的一大難題。然而，除了控制飲食和加強(qiáng)鍛煉,臨床尚缺乏藥效明確、副作用小的減肥藥物[5]。

肥胖的主要特點(diǎn)是脂肪組織重量增加，體脂占比明顯升高，而脂肪細(xì)胞儲存的三酰甘油含量持續(xù)增加導(dǎo)致脂肪細(xì)胞不斷肥大是引起脂肪組織重量增加的主要原因[6]。脂肪細(xì)胞的主要特征是它們能夠以三酰甘油的形式儲存多余的熱量，這些三酰甘油被包裝成占據(jù)脂肪細(xì)胞內(nèi)大部分空間的脂滴[7]。在高熱量攝入的早期階段，脂肪細(xì)胞會積極地儲存額外的三酰甘油，并在禁食期間保持接近正常脂質(zhì)代謝率；隨著熱量攝入的持續(xù)增加，脂肪細(xì)胞會因三酰甘油過度沉積而肥大，并引起脂肪組織重量及占比不斷升高[5-6]。

龍虎人丹是一種中草藥復(fù)方，主要由薄荷、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、兒茶和甘草等11種成分組成，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療中暑、暈動病、腹瀉等病癥，具有療效可靠、副作用少、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。之前的研究表明，龍虎人丹可通過調(diào)節(jié)血脂代謝進(jìn)而改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠動脈粥樣硬化中的血脂紊亂即能顯著降低血清三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白[10]。然而其對于肥胖小鼠中脂肪細(xì)胞肥大的保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制尚未有報(bào)道。因此，本研究旨在評價(jià)龍虎人丹改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪細(xì)胞肥大的藥理作用，并進(jìn)一步探究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

24只SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，8周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0034。

1.2 藥品與試劑

龍虎人丹由上海中華藥業(yè)有限公司提供(批號：161006)；蘇木素伊紅(H&E)染液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：0729A20)；脂聯(lián)素ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：S22017306)；SYBR Green supermix(美國Bio-Rad公司，批號：64309999)；D12492高脂飼料(Research Diets 公司，批號：150300288)；anti-β-actin 抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：O10313)；anti-CD36抗體(美國CST公司，批號：1875S，2138S)；HRP標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠二抗(美國Promega公司，批號：0000390794，0000379490)。

1.3 主要儀器

MULTISKAN GO 全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific)；LC480熒光定量PCR儀(瑞士Roche)；微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；3300029-7Q化學(xué)發(fā)光儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；BX-53熒光顯微鏡(日本Olympus)；BN-5188冰凍切片機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將24只小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為：正常對照組、模型組、龍虎人丹低劑量組(20 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床最低劑量的9倍)和龍虎人丹高劑量組(40 mg/kg，相當(dāng)于成人臨床最高劑量的9倍)，每天固定時(shí)間進(jìn)行灌胃給藥，持續(xù)16周。除正常對照組外，其余小鼠均用高脂飲食喂養(yǎng)16周，以誘導(dǎo)小鼠肥胖模型[11]。龍虎人丹使用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)稀釋。此外，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常對照組和模型組均灌胃給予0.5%CMC-Na。

小鼠麻醉后進(jìn)行眼眶取血，血樣室溫保存30 min后，3 000 r/min離心15 min，收集血清，采集的血清樣本在-80 ℃下保存，以備后用。然后脫頸椎處死小鼠，取出附睪白色脂肪組織，用生理鹽水沖洗，液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱中。部分附睪白色脂肪組織在4%(φ)多聚甲醛溶液中固定24 h后以有機(jī)溶劑梯度脫水。

1.4.2 組織病理學(xué)檢測 按上述處理方法將部分附睪白色脂肪組織固定于4%多聚甲醛溶液(4 ℃)中過夜，梯度脫水后石蠟包埋，切片(4 μm)后進(jìn)行HE染色。脂肪細(xì)胞相對面積用ImageJ進(jìn)行定量分析。

1.4.3 脂聯(lián)素測定 按前述方法獲得小鼠血清樣本。血清脂聯(lián)素含量采用商品化脂聯(lián)素ELISA試劑盒依據(jù)說明書進(jìn)行測定(武漢華美生物工程有限公司)。

1.4.4 小鼠體脂比分析 將小鼠置于EchoMRI動物組分分析儀(EchoMRIIM，中國上海)的測定槽固定后，壓緊測定槽使其無法活動，將測定槽推入動物組分分析儀后測定小鼠的體脂比。

1.4.5 熒光定量PCR[12]以TRIzol法提取各組小鼠部分附睪白色脂肪總RNA并使用PrimeScriptTMgDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并獲得cDNA。使用SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR檢測。所使用的引物如表1所示。以β-actin為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計(jì)算每個(gè)mRNA的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR中使用的引物序列

1.4.6 Western blot分析[12]脂肪組織浸沒在RIPA裂解液中進(jìn)行勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心30 min后收集上清液。BCA法進(jìn)行定量，取等量總蛋白(20～40 μg)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，第2天經(jīng)二抗孵育后用ECL發(fā)光液進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠體脂比的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠的體脂比顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠的體脂比明顯降低(P<0.01)，說明龍虎人丹可以有效逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的脂肪組織質(zhì)量增加。見圖1。

2.2 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠血清脂聯(lián)素的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清脂聯(lián)素水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠的血清脂聯(lián)素含量明顯上升(P<0.01)。以上結(jié)果提示，龍虎人丹可促進(jìn)高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪組織分泌脂聯(lián)素。見圖2。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

2.3 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪細(xì)胞肥大的影響

脂肪組織HE結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠脂肪細(xì)胞明顯肥大且細(xì)胞相對面積顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠脂肪細(xì)胞明顯減小，細(xì)胞面積定量分析也進(jìn)一步證實(shí)龍虎人丹能夠有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞肥大(P<0.01)。見圖3、4。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。

2.4 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠脂肪組織中脂質(zhì)合成基因PPARγ和ACC的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，脂質(zhì)攝取基因CD36的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)，作為三酰甘油降解的第一步也是限速酶，ATGL的mRNA表達(dá)則明顯下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠PPARγ、ACC的mRNA表達(dá)以及CD36的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，而ATGL的mRNA水平也顯著上升(P<0.01)。以上結(jié)果表明，龍虎人丹可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織脂質(zhì)代謝基因的紊亂。見圖5、6。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

A. PPARY; B. ACC; C. CD36; D. ATGL。1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。

3 討論

長期攝入高熱量飲食會引起肥胖、高脂血癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝等一系列代謝性疾病[6,13]。龍虎人丹中的胡椒是一種常見的香料，具有抗氧化和降血脂等作用[14]。最近有研究表明丁香提取物能有效抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚[15]；肉桂的藥用歷史悠久，其主要有效成分肉桂醛具有抗氧化和抗炎作用，同時(shí)對改善糖代謝和脂質(zhì)分布也有重要作用[16-17]；木香是菊科植物木香的干燥根，最新研究證實(shí)木香可以改善血糖和血脂[18]；兒茶是豆科植物兒茶的去皮枝、干的干燥煎膏，能顯著抑制三酰甘油的吸收[19]。龍虎人丹可以明顯改善小鼠動脈粥樣硬化中的血脂異常[10]。鑒于龍虎人丹的藥理效用及其對脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)作用，本文研究了其對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪細(xì)胞的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，龍虎人丹能夠顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪細(xì)胞肥大并能改善脂肪組織中的脂質(zhì)代謝紊亂：(1)龍虎人丹能夠顯著降低肥胖小鼠的脂肪占比；(2)龍虎人丹可以明顯減輕高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞擴(kuò)張和肥大；(3)龍虎人丹治療后，肥胖小鼠脂肪組織中因高脂攝入引起的脂代謝基因表達(dá)紊亂得到明顯改善。

脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種重要的細(xì)胞因子，也是外周血中含量最高的脂肪細(xì)胞因子[20]。脂聯(lián)素是機(jī)體脂肪組織質(zhì)量增加時(shí)唯一呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子，脂聯(lián)素作為一種胰島素超敏化激素，可以促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化和糖吸收，是機(jī)體脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子[21]。同時(shí)，脂聯(lián)素能明顯降低外周血中三酰甘油和低密度脂蛋白含量，增加高密度脂蛋白含量,減輕動脈粥樣硬化病變[22]。本研究表明，龍虎人丹能明顯改善高脂飲食引起的脂聯(lián)素分泌減少，從而提高脂肪酸氧化的效率，也提高了三酰甘油利用率，最終明顯減少脂肪細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的儲存。

CD36是參與脂肪酸代謝的各種組織表面重要的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,介導(dǎo)這些組織對脂肪酸的攝取[23]。細(xì)胞表面CD36的表達(dá)增多會加速細(xì)胞對脂肪酸的攝取，并顯著增加細(xì)胞內(nèi)三酰甘油的合成，造成脂質(zhì)過度堆積和細(xì)胞脂毒性[24]。本研究顯示，龍虎人丹在一定程度上逆轉(zhuǎn)了高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠脂肪組織CD36的高表達(dá)，進(jìn)而減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積并抑制脂肪細(xì)胞肥大。

綜上所述，本研究表明龍虎人丹可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪細(xì)胞肥大的組織病變程度，并顯著改善肥胖小鼠脂肪組織中的脂質(zhì)代謝紊亂。由于目前還沒有針對肥胖的特效藥，因此，龍虎人丹有望成為新型安全有效的減肥藥物。