UPLC-MS-MS法同時(shí)測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒中6種皂苷類成分

胥愛麗，鐘惠嫻，楊小龍，畢曉黎，肖觀林，陳昭，江潔怡

(1. 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095； 2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095； 3.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405)

玉屏風(fēng)顆粒由黃芪、炒白術(shù)、防風(fēng)3味藥組成，作為經(jīng)典的中藥免疫調(diào)節(jié)劑，主治“表虛不固，自汗惡風(fēng)，面色?儯&白，或體虛易感風(fēng)邪者”，臨床上廣泛應(yīng)用于機(jī)體免疫力的提高以及免疫功能失衡/低下引起的反復(fù)感冒、過敏性鼻炎、哮喘等各種疾病[1-7]。方中黃芪補(bǔ)肺益氣、固表止汗，是為君藥。黃芪主要含有多糖、黃酮及皂苷類成分，其中黃芪皂苷具有多種藥理活性。研究表明，黃芪皂苷能提高小鼠血清IL-2、IL-4含量，恢復(fù)低下的細(xì)胞免疫；降低IL-6含量，保護(hù)化療引起的骨髓造血功能損傷，促進(jìn)正常造血功能的恢復(fù)，還可升高不同證型小鼠人免疫球蛋白G(IgG1)、IgG2水平，調(diào)節(jié)小鼠IL-2/IL-4平衡，即提高IL-2水平，降低IL-4水平，以提高機(jī)體免疫力，提示黃芪皂苷在免疫系統(tǒng)疾病的治療方面發(fā)揮著重要的作用，與玉屏風(fēng)顆粒的功效密切相關(guān)[8-10]。

目前，對(duì)玉屏風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制以黃芪甲苷、黃酮類的單一成分指標(biāo)含量為主，也有UPLC-DAD指紋圖譜及UPLC-MS多成分含量測(cè)定的報(bào)道，但其皂苷類成分的多指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定方法卻尚未有報(bào)道[11-15]。本研究采用UPLC-MS法同時(shí)測(cè)定方中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ共6個(gè)皂苷類成分的含量，為全面評(píng)價(jià)玉屏風(fēng)顆粒的質(zhì)量提供有效、快速的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters UPLC- Xevo TQ-S micro三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)沃特斯公司)；XS205DU梅特勒電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；KQ700-DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

黃芪甲苷(批號(hào)：H-013-170614)、黃芪皂苷Ⅰ(批號(hào)：H-038-160905)、黃芪皂苷Ⅱ(批號(hào)：H-037-161216)、黃芪皂苷Ⅲ(批號(hào)：H-036-160908)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；異黃芪皂苷Ⅰ(批號(hào)：AF-8051838)、異黃芪皂苷Ⅱ(批號(hào)：AF-8051839)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色譜純，德國(guó)Merck)，水為超純水；甲醇(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；10批玉屏風(fēng)顆粒由國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司提供，批號(hào)分別為170329、170521、170703、170818、171012、171102、171203、180113、180317、180411。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS檢測(cè)條件

2.1.1 質(zhì)譜條件 ESI離子源，噴霧電壓2 300 V，汽化室溫度500 ℃，鞘氣(N2)流速：900 L/h，碰撞氣(Ar)流速：1 L/h，離子傳輸管溫度150 ℃；各待測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～27%A；5～11 min，27%～35%A；11～16 min，35%～50%A；16～20 min，50%～100%A)；流量：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的離子流圖分別見圖1～2。

表1 玉屏風(fēng)顆粒中6種待測(cè)化合物的質(zhì)譜條件

1.黃芪甲苷； 2.黃芪皂苷Ⅲ； 3.黃芪皂苷Ⅱ； 4.異黃芪皂苷Ⅱ； 5.黃芪皂苷Ⅰ； 6.異黃芪皂苷Ⅰ。

圖2 各待測(cè)成分離子流圖

2.2 供試品溶液的制備

取本品顆粒約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成黃芪甲苷35.5 μg/mL、黃芪皂苷Ⅲ 125.0 μg/mL、黃芪皂苷Ⅱ74.5 μg/mL、異黃芪皂苷Ⅱ63.0 μg/mL、黃芪皂苷Ⅰ81.0 μg/mL、異黃芪皂苷Ⅰ58.0 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取不同體積各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置10 mL量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取2 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得對(duì)數(shù)回歸方程及線性范圍分別為：黃芪甲苷，y=2 564x+151.5，r=0.999 8，0.1775～3.55 μg/mL；黃芪皂苷Ⅲ，y=58 173x- 712.6，r=0.999 5，0.0625～1.25 μg/mL；黃芪皂苷Ⅱ，y=1 675x+114.7，r=0.999 7，0.298～5.96 μg/mL；異黃芪皂苷Ⅱ，y=1 565x+46.24，r=0.999 5，0.1575～3.15；黃芪皂苷Ⅰ，y=1 232x+8.630，r=0.999 6，0.202 5～4.05；異黃芪皂苷Ⅰ，y=1 125x+79.59，r=0.999 7，0.29～5.8 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品(171102)，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ色譜峰峰面積的RSD值分別為1.28%、1.33%、0.99%、1.47%、1.50%、1.37%，表明方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(171102)，按“2.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件依次測(cè)定，結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.58%、2.76%、2.12%、1.56%、1.43%、1.08%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品(171102)，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ色譜峰峰面積的RSD分別為1.27%、1.26%、1.98%、1.82%、1.90%、1.82%，表明供試品溶液中的各成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批供試品(170329)約0.5 g，精密稱定6份，分別加入相應(yīng)濃度的黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ對(duì)照品溶液各0.1 mL(此處對(duì)照品為另外配制，并非使用2.3項(xiàng)下的對(duì)照品來配制的)，揮干溶劑，再按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件依次測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ分別為100.64%、97.66%、100.89%、104.57%、101.73%、98.19%，RSD分別為3.54%、1.93%、2.63%、2.42%、3.35%、2.57%，見表2。

2.4.6 樣品定量測(cè)定 取10批玉屏風(fēng)顆粒樣品，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表2 玉屏風(fēng)顆粒中6種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 (續(xù))

表3 10批玉屏風(fēng)顆粒中6種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

3 討論

采用UPLC-MS法測(cè)定制劑中成分的含量，由于是用待測(cè)組分的不同離子對(duì)來定性，因此方法對(duì)色譜條件的分離度要求不高，但玉屏風(fēng)顆粒中的黃芪所含的皂苷類成分結(jié)構(gòu)較相似，會(huì)出現(xiàn)質(zhì)荷比和碎片離子均相同的情況，故在建立多個(gè)皂苷類成分同時(shí)測(cè)定的方法時(shí)對(duì)色譜分離度有一定的要求，還需結(jié)合出峰時(shí)間來對(duì)待測(cè)組份進(jìn)行定性。皂苷類成分常采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)進(jìn)行測(cè)定，但該檢測(cè)器重現(xiàn)性較差，影響因素較多，可被液質(zhì)聯(lián)用法取代。

本研究先后考察了不同溶劑(甲醇和50%甲醇)、不同提取時(shí)間(15、30、60 min)，結(jié)果以甲醇提取效果較好，提取時(shí)間為30 min時(shí)可提取完全。對(duì)不同流動(dòng)相系統(tǒng)(乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液)進(jìn)行考察，結(jié)果顯示流動(dòng)相中加入甲酸后各成分的分子離子峰響應(yīng)較高，且峰形較好，在該方法確定的流動(dòng)相梯度洗脫下，各峰均能較好地分離，能準(zhǔn)確地對(duì)各成分進(jìn)行定量。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定玉屏風(fēng)顆粒中6個(gè)皂苷類成分(黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ)的定量分析方法，結(jié)果表明該制劑10批樣品之間差異較小，批次之間質(zhì)量較穩(wěn)定，說明玉屏風(fēng)顆粒作為全國(guó)名優(yōu)中成藥，其工藝穩(wěn)定，原料質(zhì)量控制嚴(yán)格，從而保證了制劑成品的質(zhì)量穩(wěn)定。該方法快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)全面控制玉屏風(fēng)顆粒的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。