一個(gè)肌張力障礙-帕金森綜合征的家系調(diào)查及致病基因研究

高晨雨，黃婷，陳睿，劉春梅，張穎冬，田有勇

肌張力障礙-帕金森綜合征(DP)是同時(shí)出現(xiàn)肌張力障礙和帕金森樣表現(xiàn)的疾病的統(tǒng)稱[1]，其臨床特點(diǎn)為同時(shí)出現(xiàn)肌張力障礙(定義為持續(xù)或間歇性的不自主肌肉收縮所導(dǎo)致的異常重復(fù)運(yùn)動(dòng)和/或異常姿勢的運(yùn)動(dòng)障礙)以及震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)和平衡障礙的帕金森綜合征表現(xiàn)。從病因角度通常將DP分為散發(fā)性和遺傳性兩大類，散發(fā)性的有合并肌張力障礙的帕金森病、進(jìn)行性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、皮質(zhì)基底節(jié)變性病等；遺傳性的如多巴反應(yīng)性肌張力障礙、快發(fā)病性DP、X-連鎖DP、少年型帕金森綜合征、Wilson病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)等[2]。國內(nèi)外對(duì)同時(shí)出現(xiàn)肌張力障礙及帕金森綜合征癥狀的疾病的研究文獻(xiàn)較少，其中的遺傳性疾病已經(jīng)確定了多種致病基因，包括常染色體顯性遺傳基因(ATP1A3)、常染色體隱性遺傳基因(PARK2,ATP7B等)和X-連鎖遺傳基因(TAF1)[1-3]。本研究報(bào)告一個(gè)DP家系，收集了先證者相關(guān)臨床資料并進(jìn)行了家系調(diào)查，對(duì)該家系的致病基因進(jìn)行了檢測分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 本家系為江蘇省南京市江寧區(qū)人，漢族。家系調(diào)查追溯三代共9人，2人有臨床癥狀，除先證者外，另有一名癥狀類似患者(先證者姑母)已去世(圖1)；均表現(xiàn)有肌張力障礙和帕金森綜合征。取得知情同意后，采集先證者一家三代，包括先證者、父親、母親、妹妹(2人)、弟弟(1人)、女兒(1人)及丈夫共8人的全血標(biāo)本，經(jīng)典方法提取基因組DNA。對(duì)先證者進(jìn)行了病史體征采集及在未服藥狀態(tài)下進(jìn)行統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表(UPDRS)、統(tǒng)一Wilson病評(píng)分量表(UWDRS)、Wilson病全球評(píng)估量表(GAS for WD)以及MMSE、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(MoCA)評(píng)估。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室血液生化、甲狀腺功能及銅藍(lán)蛋白等檢測。

1.2 方法

1.2.1 角膜裂隙燈、肝臟超聲、MR影像及PET成像檢查 對(duì)先證者行角膜裂隙燈檢查拍照、肝臟超聲檢查排查Wilson?。恍蓄^顱、頸段和腰段脊髓3.0 T MRI掃描排除頭顱、頸段及腰段的脊髓病變對(duì)頭面及下肢運(yùn)動(dòng)異常的影響；行頭顱18F-dopa PET/MRI黑質(zhì)、基底節(jié)區(qū)多巴顯像明確中樞多巴胺能神經(jīng)元的受累情況。

1.2.2 基因分析 采用第二代測序技術(shù)和Sanger測序技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行帕金森病相關(guān)48個(gè)已報(bào)道基因的外顯子編碼區(qū)測序(北京圣谷檢驗(yàn))。在此基礎(chǔ)上，采用目標(biāo)區(qū)域捕獲高通量測序技術(shù)，對(duì)先證者行全外顯子測序，家系7人行Sanger測序驗(yàn)證(杭州祥音生物)。所有可疑突變位點(diǎn)使用美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[4]進(jìn)行分類。SIFT軟件和Polyphen-2軟件進(jìn)行蛋白功能及保守性預(yù)測。

2 結(jié) 果

2.1 先證者資料 先證者(圖1Ⅱ-2)，女，48歲，進(jìn)行性行走困難10年。2009年5月(38歲)起出現(xiàn)左小腿痙攣性疼痛，并感行走不便，X線檢查未見異常，診斷：帕金森病，予“鹽酸金剛烷胺片”治療(200 mg/d)治療，效果不明顯。后進(jìn)行性加重，感左下肢僵硬、伸展受限，出現(xiàn)拖步。2013年覺行動(dòng)緩慢較前加重，次年再就診，予“美多芭”治療(沖擊試驗(yàn)：第1 d，125 mg/d；第2 d，187.5 mg/d；第3 d，250 mg/d；第4 d，312.5 mg/d；第5 d，375mg/d；癥狀改善不超過30%，維持375 mg/d治療)，仍無效。同年行骨髓穿刺無異常，期間雖活動(dòng)不便，仍能堅(jiān)持保潔工作。2018年僵硬、行走困難加重明顯，并伴上肢輕度震顫，間斷出現(xiàn)不自主眨眼(緊張時(shí)加重)及睡眠狀態(tài)下磨牙。外院頭顱CT檢查無異常，中腦超聲檢查顯示左側(cè)中腦黑質(zhì)強(qiáng)回聲。予“美多芭”(250～375 mg/d)、“泰舒達(dá)”(50 mg/d)治療效果欠佳，出現(xiàn)陰道不規(guī)則流血(此時(shí)已絕經(jīng)2年)，被迫停用。后反復(fù)多次用“美多芭”及“泰舒達(dá)”治療均無明顯效果，且出現(xiàn)陰道不規(guī)則流血，停藥后消失。治療過程中發(fā)現(xiàn)“苯海索片”(2 mg/d)及“氯硝西泮”(1～2 mg/d)可顯著改善部分癥狀，包括拖步、不自主眨眼及磨牙。2019年11月收住院。患者無吸煙飲酒史，否認(rèn)藥物、毒物及特殊環(huán)境暴露史。父親(圖1Ⅰ-2)2019年罹患胃癌，姑母(圖1Ⅰ-1)有震顫、動(dòng)作不穩(wěn)等類似癥狀，已去世，其他家族成員身體健康。查體：體型正常，內(nèi)科查體無明顯異常。神經(jīng)專科查體：面部表情僵硬，瞬目頻繁，下頜不自主咬合動(dòng)作。言語低沉帶爆破音。上肢對(duì)稱性靜止性震顫，四肢肌力正常，肌張力增高，左側(cè)更甚。兩側(cè)深淺感覺正常。起步緩慢，啟動(dòng)后左下肢拖曳、步態(tài)前沖。四肢腱反射()，右側(cè)Babinski征可疑陽性。未服藥狀態(tài)下：UPDRS-Ⅰ評(píng)分10分，UPDRS-Ⅱ評(píng)分14分，UPDRS-Ⅲ評(píng)分46分，GAS for WD評(píng)分14分，UWDRS-Ⅰ評(píng)分54分，UWDRS-Ⅱ評(píng)分2分，UWDRS-Ⅲ評(píng)分1分，MMSE評(píng)分30分, MoCA評(píng)分26分。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、生化、甲狀腺功能、凝血功能均正常；血清銅藍(lán)蛋白0.28 g/L。

圖1 DP家系圖。 三代共9人，出現(xiàn)臨床癥狀2例，1例死亡

2.2 裂隙燈眼角膜數(shù)碼照相 先證者裂隙燈下雙眼未見角膜K-F環(huán)(圖2)。

圖2 裂隙燈眼角膜數(shù)碼照相。 A:右眼；B:左眼，均未見K-F環(huán)

2.3 超聲 先證者肝臟超聲未見明顯異常(圖3)。

圖3 肝臟超聲。肝臟形態(tài)大小未見明顯異常，實(shí)質(zhì)回聲均勻，包膜光滑，肝內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)清晰

2.4 MRI檢查 先證者頭顱T1、T2、Flair-MRI無明顯異常；頸、腰椎MRI僅頸腰椎體輕度退變。脊髓MRI無異常(圖4)。

圖4 MRI結(jié)果。A～D：頭顱MRI雙側(cè)腦干、基底節(jié)無明顯病變,無明顯中腦、腦干萎縮；E：頸椎MRI僅見C3～C7輕度椎間盤脫出；F：腰椎MRI見L4～S1椎間盤突出或膨出，未累及脊髓

2.5 PET/MR成像 先證者腦18F-dopa PET/MRI顯像示雙側(cè)紋狀體和黑質(zhì)顯影清晰，雙側(cè)基本對(duì)稱，雙側(cè)豆?fàn)詈硕喟桶飞窠?jīng)元放射性攝取略減低(圖5)。

2.6 基因突變分析 采用NGS+Sanger測序驗(yàn)證技術(shù)，對(duì)先證者進(jìn)行帕金森病相關(guān)48個(gè)已報(bào)道基因的外顯子編碼區(qū)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示在先證者(Ⅱ-2)ATP7B基因外顯子18存在c.3792G>C (p.M1264I) 的雜合錯(cuò)義突變(圖6)，ACMG分類為臨床意義未明(PM2+PP3)，SIFT軟件預(yù)測該突變?yōu)橛泻Φ?deleterious)，Polyphen-2軟件預(yù)測為可能致病的(probably damaging)。

圖5 18F-dopa PET/MRI結(jié)果。雙側(cè)豆?fàn)詈硕喟桶飞窠?jīng)元放射性攝取略減低

圖6 ATP7B c.3792G>C(p.M1264T) Sanger測序圖

采用目標(biāo)區(qū)域俘獲高通量測序技術(shù)，對(duì)先證者血樣行進(jìn)一步的全外顯子測序及家系Sanger測序驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者(Ⅱ-1)及另外3人(Ⅰ-2、Ⅱ-4、Ⅱ-5)攜帶父源RYR1基因36號(hào)外顯子c.5972C>T(p.T1911I) 的雜合錯(cuò)義突變(圖7A)，ACMG分類為臨床意義未明(PM2+PP2+PP3)，SIFT軟件預(yù)測該突變?yōu)橛绊懙鞍坠δ艿?affect protein function)，Polyphen-2軟件預(yù)測為可能致病的(probably damaging)。其他家庭成員(Ⅰ-3、Ⅱ-1、Ⅱ-3、Ⅲ-1)均為野生型(圖7B)。

圖7 RYR1 c.5972C>T (p.T1991I)Sanger測序圖。A：突變型；B：野生型

除上述突變外，全外顯子測序還檢測到先證者攜帶母源的SETX基因10號(hào)外顯子c.2439A>C(p.E813D)雜合突變(圖8A)和GCDH基因10號(hào)外顯子c.1060G>A(p.G354S)雜合突變(圖9A)，先證者二妹及女兒(Ⅱ-4、Ⅲ-1)亦攜帶GCDH基因的雜合突變，其他家庭成員(Ⅰ-2、Ⅱ-1、Ⅱ-3、Ⅱ-5)的上述基因均為野生型(圖8B、圖9B)。上述突變致病意義均未明確。

圖8 SETX c.2439A>C(p.E813D) Sanger測序圖。A：突變型；B：野生型

圖9 GCDH c.1060G>A(p.G354S) Sanger測序圖。A：突變型；B：野生型

3 討 論

先證者中年(38歲)起病，病史10年，以單側(cè)下肢痙攣性疼痛和行走不靈活為首發(fā)癥狀，進(jìn)展緩慢，逐步出現(xiàn)動(dòng)作慢，肢體僵硬，輕度震顫，肌張力高等表現(xiàn)，同時(shí)伴不自主眨眼、口部咬合動(dòng)作及夜間磨牙和下肢行走拖拽步態(tài)。既有帕金森綜合征的癥狀，又兼有肌張力障礙的表現(xiàn)，考慮到以肌張力不全表現(xiàn)首發(fā)且癥狀突出，臨床診斷為DP。根據(jù)相關(guān)神經(jīng)功能評(píng)分，癥狀以錐體外系運(yùn)動(dòng)功能受損為主，但對(duì)多巴胺能藥物治療作用不敏感，可排除帕金森病。經(jīng)過對(duì)角膜、肝臟、腦影像學(xué)及銅藍(lán)蛋白檢查，臨床排除Wilson病。頭顱PET/MRI多巴顯像檢查示多巴胺系統(tǒng)有受損，提示先證者存在帕金森綜合征相關(guān)疾病可能。先證者沒有認(rèn)知功能受損，植物神經(jīng)損傷癥狀也不突出，無眼球活動(dòng)障礙，結(jié)合頭顱MRI結(jié)果，路易體癡呆、額顳葉變性、進(jìn)行性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮等可能出現(xiàn)DP的常見疾病均無診斷依據(jù)。脊髓MRI也排除了脊髓損傷之可能。因此，本患者病因仍不明確；多巴胺能藥物治療過程中出現(xiàn)陰道出血可能與藥物治療相關(guān)，但未見類似報(bào)告。

病史詢問中，先證者提供其親屬姑母罹患相似臨床癥狀，使得考慮到該案例是否為某種遺傳性疾病可能。首先針對(duì)先證者進(jìn)行了帕金森病相關(guān)基因的靶向測序，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)ATP7B基因外顯子18存在c.3792G>C (p.M1264I) 的雜合錯(cuò)義突變。經(jīng)查證，該變異未收入HGDM數(shù)據(jù)庫，ESP數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫及ExAC數(shù)據(jù)庫的正常人群對(duì)照中均無突變頻率數(shù)據(jù)，亦沒有檢索到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Dong等[5]曾報(bào)道，在Wilson病患者中檢測到ATP7B基因c.3791 T>C (p.M1264T)的突變，并歸類為疑似致病突變，該突變HGDM數(shù)據(jù)庫ID為CM164061，變異等級(jí)為DM(致病突變)。ATP7B基因變異導(dǎo)致的Wilson病呈常染色體隱性遺傳，單個(gè)雜合突變不足以引起疾病發(fā)生[6]。因此，用該基因的單個(gè)雜合突變不能解釋先證者的遺傳學(xué)病因。

為排查先證者可能的遺傳學(xué)病因，我們?cè)谶M(jìn)行靶向測序結(jié)果失敗的情況下，又采集了先證者家系血樣，進(jìn)一步采用目標(biāo)區(qū)域俘獲高通量測序方法進(jìn)行了全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)先證者還攜帶來自父系的RYR1基因36號(hào)外顯子c.5972C>T (p.T1991I)雜合錯(cuò)義突變，先證者妹妹、弟弟存在相同突變，但父親、妹妹以及弟弟并無類似的臨床癥狀。在GnomAD數(shù)據(jù)庫中未見該基因突變頻率報(bào)道，經(jīng)SIFT軟件預(yù)測該突變?yōu)橛绊懙鞍坠δ? Polyphen-2軟件預(yù)測為可能致病(probably damaging)。文獻(xiàn)表明，該基因變異相關(guān)的疾病主要包括：(1)中央軸空?。憾鄶?shù)為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳，顯性突變和隱性突變?cè)赗YR1基因上位置不同，顯性遺傳突變主要位于該基因100～102號(hào)外顯子，而隱性遺傳突變平均分布于該基因各個(gè)區(qū)域[7]；(2)小核肌病伴眼外肌麻痹：為常染色體隱性遺傳，累及線粒體功能[8]。以上兩種已報(bào)道的疾病均表現(xiàn)為嬰幼兒、兒童早期發(fā)病，以肌無力、肌萎縮、肌張力低下，伴或不伴眼外肌、呼吸肌、心肌受累和骨關(guān)節(jié)畸形等臨床特點(diǎn)[8]。先證者所在家系遺傳和臨床特點(diǎn)和上述已報(bào)道疾病顯然不符。因此，本家系出現(xiàn)的RYR1基因c.5972C>T雜合錯(cuò)義突變與本患者家系的致病證據(jù)需進(jìn)一步研究。

以DP為主要表現(xiàn)的遺傳性疾病還包括多巴反應(yīng)性肌張力障礙以及快發(fā)病型DP等。前者至少已被發(fā)現(xiàn)3個(gè)致病基因(GCH-1、TH、DYT14)，后者的致病基因?yàn)锳TP1A3；然而先證者及其家系中均未發(fā)現(xiàn)上述兩種類型DP的致病基因突變，且其發(fā)病年齡、起病形式以及對(duì)多巴胺能藥物治療的敏感性均與上述兩種疾病不符[1,3,9]。

先證者全外顯子測序中發(fā)現(xiàn)了另外兩個(gè)遺傳自母親的雜合突變，即SETX基因外顯子10的c.2439 A>C(p.E813D)雜合突變和GCDH基因外顯子10的c.1060G>A(p.G354S)雜合突變，家系中僅有先證者及其母攜帶SETX基因c.2439A>C突變，而有包括先證者在內(nèi)共4人攜帶GCDH基因c.1060G>A突變。但上述突變的攜帶者并無類似先證者的臨床癥狀，且這兩種基因相關(guān)的疾病(肌萎縮側(cè)索硬化癥4型、常染色體隱性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)1型、戊二酸血癥Ⅰ型)多為隱性遺傳，其表型與本家系表現(xiàn)出的DP的臨床表現(xiàn)差異較大，故難以合理解釋本家系的病因。

綜上所述，本研究報(bào)告的這類復(fù)雜臨床綜合征仍存在著診斷盲區(qū)，而采用的基因檢測手段也存在一定的局限性。本研究采用的全外顯子測序不能檢測基因的調(diào)節(jié)區(qū)域和深度內(nèi)含子區(qū)域的突變，不能反映染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常以及某些 DNA 大片段的缺失、拷貝數(shù)變異和動(dòng)態(tài)突變等特殊類型突變。此外，該家系中先證者姑媽臨床資料有限，缺乏血標(biāo)本進(jìn)行測序，限制了家系的遺傳學(xué)分析。本案例的具體遺傳學(xué)病因還需要更多研究進(jìn)行明確。