不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)新型冠狀病毒核酸的檢測(cè)結(jié)果分析

崔蕾蕾，夏愛(ài)華，王偉，邵可可(鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鹽城 224001)

核酸檢測(cè)是新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)確診的重要手段。常用的核酸檢測(cè)方法有實(shí)時(shí)熒光RT-PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增、高通量測(cè)序、PCR-飛行時(shí)間質(zhì)譜、PCR-基因芯片[1-2]。為了解我國(guó)新型冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV；國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將2019-nCoV命名為SARS-CoV-2)核酸檢測(cè)的開(kāi)展現(xiàn)狀及質(zhì)量狀況，幫助臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中存在的問(wèn)題并進(jìn)行改進(jìn)，使得核酸檢測(cè)在疾病防控工作中更好地得到應(yīng)用，國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心于2020年3月16日—24日開(kāi)展了2019-nCoV核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)室參加了此次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，并用本實(shí)驗(yàn)室使用的2種品牌提取儀、2種擴(kuò)增試劑及2臺(tái)擴(kuò)增儀組合出的8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)質(zhì)評(píng)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以了解不同檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)能力差異，為實(shí)驗(yàn)室選擇檢測(cè)試劑提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心于2020年3月16日—24日發(fā)放的12個(gè)2019-nCoV核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本，編號(hào)分別為202001、202002、202003、202004、202005、202006、202007、202008、202009、202010、202011、202012。本次室間質(zhì)評(píng)樣本均為國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心制備，為基因工程方法制備的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本，無(wú)生物傳染危險(xiǎn)性。

1.2儀器與試劑 32通道全自動(dòng)核酸提取儀AU1001及磁珠法核酸提取試劑盒(無(wú)錫百泰克公司)(a)，全自動(dòng)核酸提取儀SSNP-3000A及磁珠法核酸快速提取試劑盒(江蘇碩世公司)(b)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7300 Plus(美國(guó)ABI公司)(c)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX96(美國(guó)Bio-Rad公司)(d)，2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法，上海伯杰公司)(e)，新型冠狀病毒(2019)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法，江蘇碩世公司)(f)。

1.3方法

1.3.1RNA提取 用全自動(dòng)核酸提取儀a及b及配套試劑分別提取12個(gè)質(zhì)評(píng)樣本，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

1.3.2核酸擴(kuò)增 分別用2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒e及f，對(duì)2種提取儀提取的核酸，分別在擴(kuò)增儀c及d上進(jìn)行擴(kuò)增，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置上機(jī)的擴(kuò)增檢測(cè)參數(shù)和程序。由此分成下列檢測(cè)系統(tǒng)，A：b+f+d；B：b+e+d；C：b+f+c；D：b+e+c；E：a+f+d；F：a+e+d；G：a+f+c；H：a+d+c。

1.3.3質(zhì)量控制 每批次檢測(cè)設(shè)立1份弱陽(yáng)性質(zhì)控及3份陰性質(zhì)控，陰性質(zhì)控隨機(jī)放在臨床樣本中。弱陽(yáng)性質(zhì)控測(cè)定為陽(yáng)性，3個(gè)陰性質(zhì)控結(jié)果全部為陰性，視為在控，否則為失控，不可發(fā)出報(bào)告，應(yīng)立即分析原因，必要時(shí)需重新檢測(cè)。

1.3.4結(jié)果分析與報(bào)告

1.3.4.1基線與閾值設(shè)定 根據(jù)分析后的熒光曲線進(jìn)行參數(shù)的微調(diào)，基線取6～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)(每個(gè)檢測(cè)批次最先起跳的熒光曲線起跳前1～2個(gè)循環(huán)處)，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)陰性質(zhì)控檢測(cè)熒光曲線的最高點(diǎn)。

1.3.4.2結(jié)果分析 有內(nèi)標(biāo)的試劑盒，先分析內(nèi)標(biāo)通道是否有擴(kuò)增曲線，若有，表示本次檢測(cè)結(jié)果有效，可進(jìn)行結(jié)果的分析；若待檢靶基因通道檢測(cè)到典型S型擴(kuò)增曲線，且Ct≤設(shè)定閾值，表示該靶基因“檢出”；若“待測(cè)靶基因”通道未檢測(cè)到典型S型擴(kuò)增曲線，或Ct>設(shè)定閾值，表示該靶基因“未檢出”。若內(nèi)標(biāo)通道未檢出Ct或Ct>設(shè)定值，表示本次檢測(cè)樣本濃度太低或者有干擾抑制反應(yīng)，須重新檢測(cè)。

1.3.4.3結(jié)果判斷 要確認(rèn)某病例為陽(yáng)性，須滿(mǎn)足以下條件：同一份標(biāo)本中2019-nCoV至少2個(gè)靶標(biāo)(ORF1ab/N/E)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。如1個(gè)靶基因陽(yáng)性或檢測(cè)結(jié)果落在設(shè)置的灰區(qū)內(nèi)，標(biāo)本需進(jìn)行復(fù)測(cè)或選用另1種試劑再測(cè)，如結(jié)果仍然可疑則須重新采樣(不同部位或不同樣本類(lèi)型)進(jìn)行檢測(cè)。2種試劑結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 不同核酸檢測(cè)試劑結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1提取試劑b提取核酸的檢測(cè)結(jié)果 提取試劑b提取的核酸分別用擴(kuò)增試劑e和f，在擴(kuò)增儀c及d上進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果Ct值見(jiàn)表2。

表2 快速提取試劑b提取核酸的Ct值

2.2提取試劑a提取核酸的檢測(cè)結(jié)果 提取試劑a提取的核酸分別用擴(kuò)增試劑e和f，在擴(kuò)增儀c及d上進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果Ct值見(jiàn)表3。

表3 提取試劑a提取核酸的Ct值

2.3各檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果 12個(gè)室間質(zhì)評(píng)樣本中，202003及202009未納入統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，其余10個(gè)樣本的預(yù)期檢測(cè)結(jié)果為5份2019-nCoV陽(yáng)性，5份2019-nCoV陰性。8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)均檢測(cè)出202004、202008、202011，均未檢出202010(128 copies/mL)；對(duì)202002(640 copies/mL)，只有B及D 2個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)檢出，其余均未檢出。

表4 各檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期檢測(cè)結(jié)果比較

2.4不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果各靶區(qū)域的檢測(cè)情況 2種擴(kuò)增試劑擴(kuò)增的靶區(qū)域相同，均為ORF1ab及N基因，8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)2個(gè)靶區(qū)域的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5、表6。N基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于病毒載量高的樣本的檢測(cè)能力相同，主要區(qū)別在于對(duì)病毒拷貝數(shù)低的樣本的檢測(cè)能力存在差異，B及D檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)于其他檢測(cè)系統(tǒng)，起主導(dǎo)作用的主要是B及D 2個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)所使用的e擴(kuò)增試劑的檢測(cè)能力優(yōu)于A及C檢測(cè)系統(tǒng)所使用的f擴(kuò)增試劑。對(duì)于ORF1ab基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A-D檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到的ORF1ab基因的陽(yáng)性率高于E-H檢測(cè)系統(tǒng)，A-D檢測(cè)系統(tǒng)均使用的是b快速提取試劑，而E-H檢測(cè)系統(tǒng)使用的是a提取試劑，提取試劑的提取效率對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。

表5 不同檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性結(jié)果的ORF1ab靶區(qū)域檢測(cè)情況

表6 不同檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性結(jié)果的N靶區(qū)域檢測(cè)情況

3 討論

本次室內(nèi)質(zhì)評(píng)的5份陽(yáng)性樣本中，要求實(shí)驗(yàn)室能夠檢出202011(8×104copies/mL)、202008(1.6×104copies/mL)、202004(3.2×103copies/mL)、202002(640 copies/mL)4個(gè)濃度水平的樣本。8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)均檢測(cè)出202004、202008、202011；主要的問(wèn)題存在于對(duì)640 copies/mL弱陽(yáng)性樣本檢出能力。由于202002(640 copies/mL)病毒拷貝數(shù)均低于f擴(kuò)增試劑及e擴(kuò)增試劑的檢測(cè)下限，8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中，只有B及D 2個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)檢出，其余均未檢出。B及D檢測(cè)系統(tǒng)中，提取試劑均為b快速提取試劑，擴(kuò)增試劑均為e擴(kuò)增試劑，擴(kuò)增儀分別為c及d，提取試劑及擴(kuò)增儀相同的A及C檢測(cè)系統(tǒng)卻未檢出，說(shuō)明其差別主要在于擴(kuò)增試劑不同，2種擴(kuò)增試劑均使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法，雖然2種檢測(cè)試劑聲稱(chēng)的分析靈敏度均為1 000 copies/mL ，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，2種試劑的分析靈敏度存在差異。擴(kuò)增試劑e各陽(yáng)性樣本檢測(cè)的符合率總體優(yōu)于f擴(kuò)增試劑。導(dǎo)致檢測(cè)假陰性的原因涉及核酸提取和檢測(cè)2個(gè)過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)室使用的核酸提取方法為自動(dòng)化儀器+磁珠提取法，使用的核酸提取試劑種類(lèi)為2種。2種核酸提取試劑的磁珠吸附效率、用于核酸提取的樣本量、洗脫體積也各有不同，因此，即使2種提取試劑磁珠吸附效率相同，提取核酸濃度亦不相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)提取試劑b提取的靶基因檢出率高于提取試劑a，同時(shí)其Ct值亦較a低。

目前，多數(shù)試劑廠家選擇2019-nCoV核酸序列的2個(gè)或2個(gè)以上的區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，ORF1ab、N區(qū)和E區(qū)是常見(jiàn)的檢測(cè)區(qū)域[3]。本實(shí)驗(yàn)室使用的2種擴(kuò)增試劑都是檢測(cè)ORF1ab、N區(qū)，不同靶區(qū)域的敏感性也存在差異。本次室間質(zhì)評(píng)樣本為ORF區(qū)和N區(qū)連接在一起的病毒樣顆粒，因此ORF和N區(qū)的數(shù)量完全一致，但是2種擴(kuò)增試劑對(duì)2個(gè)區(qū)域檢測(cè)的陽(yáng)性率差異明顯?？偟膩?lái)說(shuō)，N區(qū)的陽(yáng)性率高于ORF區(qū)，病毒拷貝數(shù)越低，這一現(xiàn)象越顯著。

本次室間質(zhì)評(píng)含有5份2019-nCoV陰性樣本，主要考核檢測(cè)的特異性以及是否存在實(shí)驗(yàn)室污染。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，8個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)5份陰性樣本均為未檢出，與預(yù)期結(jié)果相符，未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性，說(shuō)明本室使用的2種擴(kuò)增試劑與其他冠狀病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

本研究使用的樣本為基因工程方法制備的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本，與人體標(biāo)本基質(zhì)不同，可能導(dǎo)致不同核酸提取試劑對(duì)其處理能力的不同而使得結(jié)果產(chǎn)生差異，結(jié)果不能完全代表實(shí)際檢測(cè)結(jié)果。另外，本研究?jī)H僅對(duì)各試劑某一批號(hào)的檢測(cè)能力作了簡(jiǎn)要比較分析，并且由于樣本數(shù)量有限，也不能完全代表試劑的總體檢測(cè)性能。因缺乏2019-nCoV核酸陽(yáng)性樣本，如有條件，應(yīng)使用陽(yáng)性樣本代替室間質(zhì)評(píng)樣本，同時(shí)擴(kuò)大樣本數(shù)量，進(jìn)一步對(duì)核酸提取試劑的提取質(zhì)量、檢測(cè)試劑性能等指標(biāo)進(jìn)行有效評(píng)價(jià)。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡量選用配套檢測(cè)系統(tǒng)，如選用非配套系統(tǒng)，應(yīng)該對(duì)配套系統(tǒng)與非配套系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì)，確保所選用的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用參與核酸提取過(guò)程的弱陽(yáng)性樣本和多份(如 3 份)陰性樣本，進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，以有效監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)弱陽(yáng)性樣本的檢測(cè)能力和實(shí)驗(yàn)室污染；還應(yīng)加強(qiáng)人員實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果解讀能力的培訓(xùn)。