不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤酶和土壤微生物研究

郭輝，唐衛(wèi)平

1. 四川美術(shù)學(xué)院建筑與環(huán)境藝術(shù)學(xué)院，重慶 401331；2. 重慶大學(xué)建筑城規(guī)學(xué)院，重慶 400030；3. 河南省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，河南 鄭州 450045

作為地球化學(xué)循環(huán)過程中的重要參與者，土壤微生物參與土壤中有機(jī)質(zhì)分解、元素循環(huán)和土壤礦化等化學(xué)活動，能夠促進(jìn)土壤物質(zhì)循環(huán)，穩(wěn)定與保持土壤的生產(chǎn)力和健康（石柯等，2019）。微生物的多樣性是增強(qiáng)微生物功能和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要因素（亓琳等，2017；于德良等，2019）。作為直接受植物根系和分泌物影響的土壤區(qū)域，根際土壤為土壤微生物與植物相互作用提供了場所（黃娜等，2019），使微生物與根系之間保持了適應(yīng)性協(xié)同進(jìn)化和互惠的關(guān)系（鮑勇等，2018；胡留杰等，2018；徐忠山等，2018）。在植物根系活動的影響下，根際土壤的養(yǎng)分含量及其他土壤理化性質(zhì)發(fā)生了變化，進(jìn)一步使根際微生物群落的組成發(fā)生改變，非根際與根際土微生物群落組成和多樣性也出現(xiàn)了很大的差異。植物生長需要根際微生物的參與和作用，土壤營養(yǎng)物質(zhì)能夠被促植物生長細(xì)菌（PGPR）的代謝活動進(jìn)行分解、轉(zhuǎn)化，成為植物可吸收利用的形態(tài)后被吸收，有效地促進(jìn)了植物的生長，而一些細(xì)菌分泌的激素能夠提高植物的適應(yīng)性（孫英杰等，2018；張守都等，2019）。植物的種類、健康狀況、生長階段等因素會影響根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。另外，如土壤營養(yǎng)狀況、pH、溫度和水分等土壤理化性質(zhì)會對微生物群落產(chǎn)生較大影響。

土壤微生物作為絕大多數(shù)陸生植物生長的載體，其肥力和活性不僅受到土壤養(yǎng)分和水分的影響，同時也受到外界環(huán)境的調(diào)控作用，不同的微生物種群具有不同的降解和分解速率，其活性和新陳代謝也發(fā)生較大的差異，腐殖質(zhì)和有機(jī)質(zhì)的分解離不開其分解作用，從而將有機(jī)質(zhì)等轉(zhuǎn)化為能夠被土壤植被利用的土壤養(yǎng)分，進(jìn)而維持植株生長發(fā)育（Ma et al.，2016）。作為土壤生態(tài)的重要一環(huán)，微生物的新陳代謝等活動直接決定著土壤物質(zhì)和能量交換及循環(huán)，維持著整個土壤養(yǎng)分的動態(tài)轉(zhuǎn)換及循環(huán)，常常被作為土壤肥力的體現(xiàn)指標(biāo)之一（Xue et al.，2006）。一旦生態(tài)環(huán)境發(fā)生較明顯的改變，其中的環(huán)境因子則會隨之發(fā)生相應(yīng)的變化，土壤微生物亦是如此，在土壤生態(tài)不斷變化的過程中微生物活動也隨之改變，不僅微生物能夠通過分解和轉(zhuǎn)換有機(jī)質(zhì)等維持土壤養(yǎng)分循環(huán)，同時土壤養(yǎng)分也反作用于微生物。由于研究手段和方法有限，多數(shù)研究側(cè)重于微生物量的研究（周恒等，2019），而近年來其多樣性研究也不斷加深，這主要得益于生物分析技術(shù)的進(jìn)步，不僅從物種方面開展相應(yīng)研究，更從其功能及遺傳方面的多樣性開展一系列探究，從而更加豐富了微生物多樣性研究。

本研究以華北落葉松Larix principis-rupprechtii人工林為對象，通過分析目前林地內(nèi)不同林分密度落葉松人工林的生長狀況，同時分析土壤養(yǎng)分的差異變化，了解華北落葉松人工林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化特征，并探討了其與土壤養(yǎng)分、土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性之間的關(guān)系，為華北落葉松人工林可持續(xù)經(jīng)營和維持該地區(qū)土壤肥力提供科學(xué)依據(jù)，以期實(shí)現(xiàn)更大的效益和價值。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于河北省圍場縣境內(nèi)的木蘭國營林場（116°32′—118°14′E，41°35′—42°40′N），該區(qū)南臨京津地區(qū)，北接內(nèi)蒙古渾善達(dá)克沙地，屬于中溫帶向寒溫帶過渡、半干旱向半濕潤過渡的山地氣候，具有水熱同季、冬長夏短、四季分明、晝夜溫差大的特征，年均氣溫?1.4—4.7 ℃，最高氣溫38.9 ℃，最低氣溫?42.9 ℃，年均降水量380—560 mm，主要集中在7—9月，平均日照為2832 h。災(zāi)害天氣主要有暴雨、冰雹、沙暴等。林場內(nèi)土壤有棕壤、褐土、風(fēng)砂土、草甸土、沼澤土、灰色森林土和黑土7類，分為7個植被類型53個群系，有維管植物科382屬693種。主要喬木有華北落葉松、云杉Picea asperata、白樺Betula platyphylla等；主要灌木有山杏Prunus sibirica、繡線菊Spiraea salicifolia、照山白Manchurianrhododendron等；主要草本植物有羊胡子草（Eriophorum）、披堿草Elymus dahuricus等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 樣地設(shè)置

分別在2016—2018年選取林場內(nèi)6塊華北落葉松人工林樣地，每塊調(diào)查樣地大小為30 m×30 m，對樣地進(jìn)行調(diào)查，測量胸徑、樹高、枝下高和冠幅。采用“S”型采樣法采集土壤樣品，每塊樣地設(shè)置5個樣點(diǎn)，每個樣點(diǎn)采集5個重復(fù)，用土鉆采取0—20 cm土層的土樣，采集150個土樣，3年共采集450個土壤樣品。放入鋁盒內(nèi)保存帶回實(shí)驗(yàn)室，將土樣中的雜質(zhì)去除，自然風(fēng)干、研磨、過篩后，放入封口袋保存，用于后期土壤養(yǎng)分的分析測定。

1.2.2 土壤樣品的測定

根際土壤采用“抖落法”，首先在各樣方取出1 kg土壤，取樣深度最大為20 cm，將土樣混勻后帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干，待測。使用元素分析儀對全氮含量進(jìn)行分析測定；分別采用比色法、光度計(jì)法對速效磷、鉀含量進(jìn)行分析；分別采用滴定法、平板梯度稀釋法和比色法測定土壤脫氫酶、過氧化氫酶及脲酶；采用重鉻酸鉀外加熱法測定有機(jī)碳；pH采用pH計(jì)測定；采用鉬銻抗比色法測定有效磷。

1.2.3 土壤微生物群落功能多樣性

多樣性分析所用數(shù)據(jù)需要在Biolog-Eco下進(jìn)行72 h的溫育處理，之后將等同于10 g烘干土壤的土樣加入 NaCl溶液，要求濃度為 0.145 mol·L?1，振蕩30 min，然后將其中的100 μL接種于Eco板后讀數(shù)，恒溫培養(yǎng)要求在 25 ℃下進(jìn)行 216 h，并隔12 h一次讀數(shù)；之后，在NaCl溶液中進(jìn)行稀釋后進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，并做好吸光值記錄。

通過分析其對碳源的反應(yīng)情況來探究微生物對碳源的利用水平，在研究中常用平均每孔顏色變化率 AWCD來表示，該值越大說明其具有較高的微生物豐度，計(jì)算式如下（賀文員等，2019）：

式中，Ci、R分別表示第i孔、對照孔的吸光值。

式中，Pi為第i孔的相對吸光值比值，計(jì)算公式：

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2007和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差檢驗(yàn)，以平均值（2016—2018）±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SE）表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)法檢驗(yàn)各指標(biāo)之間的相關(guān)性，所有原始數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換；變量的顯著性經(jīng)過蒙特卡洛（Monte Carlo）檢驗(yàn)（499次），CANOCO 4.5繼續(xù)排序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤理化性質(zhì)

從表1可知，華北落葉松根際和非根際土壤pH隨著林齡增加呈先降低后增加趨勢，在成熟林達(dá)到最??；不同林齡華北落葉松根際土壤pH顯著低于非根際（P＜0.05），說明由于根在土壤中長期生長，過程中不斷向根際分泌出有機(jī)化合物，華北落葉松林的土壤pH處于弱酸性，屬較強(qiáng)酸性土壤，隨著林齡的增大，pH也逐漸增加。華北落葉松根際和非根際土壤有機(jī)碳隨著林齡增加呈增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；幼林、中林和成熟林根際土壤有機(jī)碳顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際土壤有機(jī)碳與非根際差異不顯著（P＞0.05）。華北落葉松根際和非根際土壤全氮隨著林齡增加呈增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；幼林、中林和成熟林根際土壤全氮顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際土壤全氮與非根際差異不顯著（P＞0.05）。華北落葉松根際和非根際土壤全磷隨著林齡增加呈增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；不同林齡華北落葉松根際土壤全磷與非根際差異均不顯著（P＞0.05）。華北落葉松根際和非根際土壤有效磷隨著林齡增加呈增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；幼林、中林和成熟林根際土壤有效磷顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際土壤有效磷與非根際差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤酶活性

由表2可知，華北落葉松根際和非根際土壤酶活性隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大。其中華北落葉松根際和非根際土壤脲酶活性、蔗糖酶活性、過氧化氫酶活性和堿性磷酸酶活性隨著林齡增加呈增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；幼林、中林和成熟林根際土壤顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際與非根際差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 華北落葉松人工林土壤微生物數(shù)量

由表3可知，華北落葉松根際和非根際土壤微生物數(shù)量隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大。其中華北落葉松根際和非根際土壤細(xì)菌數(shù)目、真菌數(shù)目、放線菌數(shù)目和微生物總數(shù)隨著林齡增加呈增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；幼林、中林和成熟林根際土壤顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際與非根際差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤養(yǎng)分Table 1 Soil nutrients in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

表2 不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

表3 不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤微生物數(shù)量Table 3 The number of microbes in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

2.4 華北落葉松人工林土壤微生物群落多樣性

由表4可知，華北落葉松根際和非根際土壤微生物多樣性指數(shù)隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大。其中華北落葉松根際和非根際物種豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)和碳源利用指數(shù)隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；幼林、中林和成熟林根際豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)和碳源利用指數(shù)顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際與非根際差異不顯著（P＞0.05）。不同林齡根際與非根際優(yōu)勢度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 土壤養(yǎng)分與微生物多樣性之間相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果表明（表 5），土壤微生物群落多樣性與土壤pH之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，與土壤養(yǎng)分（除了全磷）均呈正相關(guān)關(guān)系，其中物種豐富度指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）和碳源利用指數(shù)（S）與土壤 pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與土壤養(yǎng)分（除了全磷）均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系；優(yōu)勢度指數(shù)（Ds）與土壤養(yǎng)分相關(guān)性不顯著（P＞0.05）；而土壤有機(jī)碳和全氮的相關(guān)系數(shù)最大，說明土壤養(yǎng)分對土壤微生物群落多樣性的貢獻(xiàn)較大。

由表6可知，土壤微生物群落多樣性與土壤微生物數(shù)目（除了放線菌數(shù)目）均呈正相關(guān)關(guān)系，其中物種豐富度指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）和碳源利用指數(shù)（S）與土壤微生物數(shù)目（除了放線菌數(shù)目）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；優(yōu)勢度指數(shù)（Ds）與土壤微生物數(shù)目相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。土壤微生物群落多樣性與土壤酶活性（除了蔗糖酶）均呈正相關(guān)關(guān)系，其中物種豐富度指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）和碳源利用指數(shù)（S）與土壤酶活性（除了蔗糖酶）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；優(yōu)勢度指數(shù)（Ds）與土壤酶活性相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。由此可知，土壤養(yǎng)分和微生物數(shù)量與微生物群落功能多樣性密切相關(guān)，其中土壤pH對土壤微生物群落功能多樣性貢獻(xiàn)為負(fù)，土壤養(yǎng)分對土壤微生物群落功能多樣性貢獻(xiàn)為正，這是造成土壤微生物群落多樣性季節(jié)性差異的重要原因。

表4 不同林齡華北落葉松根際與非根際土壤微生物群落多樣性Table 4 Soil microbial community diversity in rhizosphere and non-rhizosphere of different ages of Larix principis-rupprechtii

表5 土壤養(yǎng)分與微生物多樣性之間相關(guān)性Table 5 Correlation between soil nutrient and microbial diversity

表6 土壤微生物數(shù)目和酶活性與微生物多樣性之間相關(guān)性Table 6 Correlation among the number of microbe，enzymatic activities and microbial diversity

2.6 土壤微生物群落的RDA分析

蒙特卡羅置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示，第一典范軸P＜0.05，表明該排序模型的解釋變量（即土壤環(huán)境因子）與響應(yīng)變量（即土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)）的變化關(guān)系較顯著。華北落葉松根際土壤細(xì)菌和真菌群落與土壤環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果見圖 1。對于根際，RDA前兩個排序軸的特征值分別為 0.63和0.19，分別解釋了63%和19%的細(xì)菌多樣性變化。本文所選的土壤環(huán)境因子共解釋了 82%的總特征值，對華北落葉松根際土壤細(xì)菌群落有顯著影響。其中對土壤細(xì)菌多樣性影響較大的有SOC和TN，而pH對土壤細(xì)菌多樣性影響為負(fù)。對于非根際，RDA前兩個排序軸的特征值分別為0.59和0.28，分別解釋了59%和28%的微生物多樣性變化。本文所選的土壤環(huán)境因子共解釋了87%的總特征值，對華北落葉松根際土壤真菌多樣性有顯著影響。其中對土壤真菌多樣性影響較大的有SOC和TN，而pH對土壤真菌多樣性影響為負(fù)。

3 討論

圖1 土壤根際和非根際土壤微生物多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系Fig. 1 Relationship between soil microbial diversity and environmental factors in rhizosphere and non-rhizosphere soils

土壤微生物群落對碳源的利用能力也會出現(xiàn)較大差異，這主要是其群落分布數(shù)量及功能等方面存在較大差異，在微生物研究過程中常常使用豐度及多樣性指數(shù)開展相應(yīng)的研究（魏楓等，2019）。Shannon指數(shù)基于顏色變化率的基礎(chǔ)上開展微生物對碳源的利用能力，主要側(cè)重于功能方面，該指數(shù)越大的情況下則說明微生物能夠利用更多種類的碳源、且利用效率更高，該指標(biāo)是一種正向的表示（Gao et al.，2010；Stark et al.，2008）；Mc-Intosh指數(shù)主要是對物種均一分布特性方面的研究，當(dāng)微生物對碳源利用量更大、利用種類更多的情況下，該指數(shù)也越大，這也是一種正向的表示（余薇薇等，2018）。Simpson指數(shù)更多地反映的是碳源嗜好。均勻度指數(shù)能夠在多樣性指數(shù)的基礎(chǔ)上通過計(jì)算而得，這主要受到兩個方面的影響：第一，微生物分布的種類，也就是我們常說的豐度；第二，該微生物分布是否呈現(xiàn)均勻分布，微生物的種類越多，也就意味著其具有更明顯的多樣性，其分布更均勻的情況下能夠增加其分布數(shù)量，也就是提升了多樣性。本研究中，華北落葉松根際和非根際物種豐富度指數(shù)（H）、均勻度指數(shù)（E）、優(yōu)勢度指數(shù)（Ds）和碳源利用豐富度指數(shù)（S）隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大，幼林、中林和成熟林根際顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際與非根際差異不顯著（P＞0.05）。主要原因在于成熟林根系生長旺盛，分泌較多根系分泌物，對于促進(jìn)生物量增長作用明顯，加之養(yǎng)分富集效應(yīng)，形成了更高水平的根系養(yǎng)分含量（張宇沖等，2019）。此外，其在降塵物質(zhì)的作用下及腐殖質(zhì)影響下，根際沉積更為明顯，這對于微生物活動也起著積極作用，能夠促進(jìn)微生物生長發(fā)育，進(jìn)而加快有機(jī)質(zhì)分解和降解，對于養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化起著積極作用，因此形成更高的養(yǎng)分含量（梁晉剛等，2019；劉福春，2019）。對于土壤pH值，華北落葉松根際和非根際土壤pH隨著林齡增加呈先降低后增加趨勢，在成熟林達(dá)到最小，不同林齡華北落葉松根際土壤 pH顯著低于非根際（P＜0.05）；說明由于根在土壤中長期生長，過程中不斷向根際分泌出有機(jī)化合物，華北落葉松林的土壤 pH處于弱酸性，屬較強(qiáng)酸性土壤，隨著林齡的增大，pH也逐漸增加。

華北落葉松根際和非根際土壤蔗糖酶活性、堿性磷酸酶活性、脲酶活性和過氧化氫酶活性隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大，幼林、中林和成熟林根際顯著高于非根際（P＜0.05），而過熟林根際與非根際差異不顯著（P＞0.05），這反映了根際聚集效應(yīng)，表明土壤中的有效鉀、有效磷含量較高。但是對于幼齡華北落葉松來說，其根系并未發(fā)育完善，根產(chǎn)物較少，所以主要通過腐殖質(zhì)分解獲得有機(jī)質(zhì)；對于中齡林和成熟林來說，可以通過根產(chǎn)物收獲大量的有機(jī)質(zhì)。隨著華北落葉松林齡的增加，土壤酶活性會呈現(xiàn)“低-高-低”的狀態(tài)，先降后升，于中齡時達(dá)到最高點(diǎn)后再開始下降。研究顯示，根際酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非根際酶活性（Asadishad et al.，2018），華北落葉松根系分泌的酶進(jìn)入土壤會形成極強(qiáng)的酶活性。在微生物作用下，根際的作用范圍縮小，微生物分布數(shù)量及養(yǎng)分在外界環(huán)境變化的情況下，會改變內(nèi)部結(jié)構(gòu)，直接影響酶的分泌，導(dǎo)致不同土壤區(qū)域的酶活性出現(xiàn)較大差異。

土壤微生物能夠?qū)⒏迟|(zhì)等有機(jī)質(zhì)進(jìn)行分解及降解，從而使之能夠轉(zhuǎn)化為土壤養(yǎng)分以供植物吸收利用，形成土壤養(yǎng)分，從而明顯改善土壤肥力，同時對土壤理化特性起著改善作用，進(jìn)而為植被生長提供更加良好的土壤條件，促進(jìn)植被生長發(fā)育，同時利于微生物活動，增強(qiáng)微生物的群落分布豐度和均勻度（Li et al.，2015）；另一方面，微生物活動也需要必要的養(yǎng)分以維持其新陳代謝等活動，該部分養(yǎng)分主要來源于土壤，因此二者關(guān)系密切（Knelman et al.，2015；Crecchio et al.，2004）。土壤養(yǎng)分和微生物數(shù)量與微生物群落功能多樣性密切相關(guān)，其中土壤pH對土壤微生物群落功能多樣性貢獻(xiàn)為負(fù)，土壤養(yǎng)分對土壤微生物群落功能多樣性貢獻(xiàn)為正，這是造成土壤微生物群落多樣性季節(jié)性差異的重要原因。

4 結(jié)論

華北落葉松根際和非根際土壤pH隨著林齡增加呈先降低后增加趨勢，而土壤有機(jī)碳、全氮和有效磷隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大；華北落葉松根際和非根際土壤細(xì)菌數(shù)目、真菌數(shù)目、放線菌數(shù)目、微生物總數(shù)、土壤蔗糖酶活性、堿性磷酸酶活性、脲酶活性和過氧化氫酶活性隨著林齡增加呈先增加后降低趨勢，在成熟林達(dá)到最大。土壤養(yǎng)分、土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性均與土壤微生物群落多樣性具有顯著的相關(guān)性，其中，土壤養(yǎng)分對微生物群落多樣性的貢獻(xiàn)最大（其相關(guān)系數(shù)絕對值最大）。冗余分析表明土壤微生物群落多樣性與土壤養(yǎng)分含量均呈正相關(guān)（除了 pH），全碳和全氮與豐富度指數(shù)相關(guān)性最大，由此可知，有機(jī)碳和全氮是影響該區(qū)土壤微生物群落多樣性分布的主要因子。綜合來看，除了pH之外，土壤養(yǎng)分對微生物分布產(chǎn)生多方面的制約作用，且是正向的影響作用，其中全碳及全氮的影響最大，這也是不同的土壤類型其微生物分布也存在顯著差異的原因之一。土壤環(huán)境因子能夠顯著影響微生物分布，不同的植被分布也對微生物活動產(chǎn)生明顯的制約作用，土壤環(huán)境因子的復(fù)雜性使得微生物分布也具有很大的復(fù)雜性。